动物垫料中沙门氏菌检测DB15／T 1848—2020.pdf

ICS 07.100.99 B 41 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1848 2020 动物垫料 中沙门氏 菌检测 Detection for salmonella in animal bedding 2020-02-25 发布 2020-03-25 实施 内 蒙 古 自 治 区 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB15/T 1848 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由中 华人 民共 和国 呼和浩 特海 关提 出并 归口。本标准 起草 单位：中 华人 民共和 国呼 和浩 特海 关、内蒙古 农业 大学、内 蒙古 自治区 农牧 业科 学 院。本标准 主要起 草人：赵治 国、崔 强、王 海艳、于志 超、陈 林军、延涵、任彩 霞、潘 国卿、姚利 宏、陈少博、罗 晓平、李 军燕。DB15/T 1848 2020 1 动 物垫料 中沙门氏 菌检测 1 范围 本标准 规定 了动 物垫 料中 沙门氏 菌的 分离 鉴定 定性 检测法。本 标准 适用 于动 物垫 料 中沙门 氏菌 定性 检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB 19489 实验 室 生物 安 全通用 要求 GB/T 33682 基 质辅 助激 光解析 电离 飞行 时间 质谱 鉴别微 生物 方法 通则 SN/T 1538.1 培养 基制 备 指南 第1 部分：实 验室 培 养基制 备质 量保 证通 则 SN/T 1538.2 培养 基制 备 指南 第2 部分：培 养基 性 能测试 实用 指南 3 术语和 定义 下列术语 和定义 适用于 本文 件。3.1 动 物垫料 animal bedding 用于吸收 动物排 泄物，使 动 物保持舒 适生活 环境的 铺垫 物。包括动 物笼内 非直接 与 动物机体 接触的 铺垫物。4 设备和 材料 4.1 冰箱：2 5。4.2 恒温 培养 箱：36 1，42 1。4.3 均质 器。4.4 漩涡 振荡 器。4.5 电子 天平：感 量0.1 g，0.0001 g 4.6 全自 动微 生物 生化 鉴 定系统。4.7 飞行 时间 质谱 仪。4.8 二级 生物 安全 柜。4.9 pH 计。4.10 微量 移液 器。4.11 无菌 锥形 瓶：容量500 mL，250 mL。DB15/T 1848 2020 2 4.12 无菌 吸管：1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)或微 量移 液器 及吸头。4.13 无菌 培养 皿：15 mm 90 mm。4.14 无菌 试管：18 mm 180 mm。4.15 无菌 棉签。4.16 无菌 镊子。4.17 无菌 剪刀。4.18 无菌 勺。4.19 无菌 玻片。4.20 无菌 接种 环。5 培养基 和试 剂 5.1 实验 用水：符 合GB/T 6682 的要 求。5.2 缓冲 蛋白 胨水(BPW)：见附 录A.2。5.3 MkTTn 肉汤：见 附录A.3。5.4 亚硒 酸盐 胱氨 酸(SC)增菌液：见 附录A.4。5.5 亚硫 酸铋(BS)琼脂：见附录A.5。5.6 HE 琼 脂：见附 录A.6。5.7 木糖 赖氨 酸脱 氧胆 盐(XLD)琼脂：见 附录A.7。5.5 沙门 氏菌 属显 色培 养 基。5.9 三糖 铁(TSI)琼 脂：见附录A.8。5.10 蛋白 胨水、靛 基质 试剂：见附录A.9。5.11 尿素 琼脂(pH7.2)：见附录A.10。5.12 氰化 钾(KCN)培养 基：见附 录A.11。5.13 赖氨 酸脱 羧酶 试验 培养基：见 附录A.12。5.14 糖发 酵管：见 附录A.13。5.15 邻硝 基酚-D 半乳 糖苷(ONPG)培养 基：见附 录A.14。5.16 半固 体琼 脂：见附录A.15。5.17 丙二 酸钠 培养 基：见附录A.16。5.18 无菌 生理 盐水：见 附录A.17。5.19 生化 鉴定 试剂 盒。5.20 革兰 氏染 液。5.21 革兰 氏阴 性菌 生化 鉴定卡。5.22 飞行 质谱 仪靶 板。5.23 沙门 氏菌 标准 菌株 ATCC 13311 或等 效菌 株。5.24 大肠 杆菌 标准 菌株 CMCC 44102 或等 效菌 株。5.25 产气 肠杆 菌标 准菌 株 ATCC 13048 或等 效菌 株。6 检验程 序 沙 门氏 菌检 验程 序见 图1。DB15/T 1848 2020 3 36 1，16 h 20 h 36 1，24 h 2 h 361，18 h 24 h 36 1，40 h 48 h 36 1，18 h 24 h 图1 沙门氏 菌检 验程 序 7 操作步 骤 7.1 采样 样品制 备 检样25g 或25cm2样液+225mL BPW 预 增菌 1mL+10mL MkTTn 1mL+10mL SC BS 琼 脂平 板 XLD（或 HE、显 色培 养基）挑取纯 培养 后的 可疑 菌落 生化鉴 定和/或全 自动 检测 设备 鉴定 沙门氏 菌 非沙门 氏菌 血清学 鉴定 报 告 DB15/T 1848 2020 4 7.1.1 采样原 则 样品采集 应遵循 随机性、代 表性的原 则。采 样过程 遵循 无菌操作 程序，防止一 切可 能的外来 污染。7.1.2 颗粒状 或粉 末样 品 对送检 样品 包装 内不 同部 位样品 进行 随机 多点 取样 至少 250 g，充分 混匀 后 称取 25 g 颗 粒状 或粉末状垫 料样 品，加 入 225 mL BPW，充 分振 摇或 均 质1 min 2 min，置 36 1 培养 16 h 20 h，进行预 增菌。7.1.3 平面样 品 无菌操 作将 灭菌 规格 板（5 cm 5 cm）放在 平面 垫料 表面，用浸 有无 菌稀 释液（磷酸 缓冲 液或 生理盐水）的棉拭 子，在规格 板内来 回均匀 涂抹 整个方 格 3 次，并 随之转 动棉 拭 子，然 后用灭 菌剪 刀剪去棉拭子 与手接 触的 部分，将棉拭 子头置 入装 有 25 mL 无菌 稀释液 的无 菌锥形 瓶中，根据样 品面 积 大小重复取 样 1 4 个规 格板 面 积，相 应地 将棉 拭子 头置 入 25 mL 100 mL 的 无菌 稀释液 中，充分 振摇 制成样品原 液（1 mL 原 液对 应 的样品 面积 为 1 cm2）。取25 mL 样 品原 液加 入 225 mL BPW，充 分振 摇或 均质1 min 2 min，置 36 1 培养 16 h 20 h 进 行预增 菌。表1 不同面 积平 面类 垫料 样品 采样量 样品面积 m2 采样量 cm2 规格板数 小于0.25（含）25 1 0.25 0.5（含）50 2 0.5 0.75（含）75 3 大于0.75 100 4 7.2 选择 性 增菌 轻 轻摇 动培 养过 的样 品混合 物，移 取 1 mL 转种 于 10 mL MkTTn 肉汤 内，于 36 1 培 养 24 h2 h。同 时，另取1 mL 转种 于 10 mL SC 增 菌液 中，于 36 1 培 养18 h 24 h。7.3 分离培 养 用直径3 mm 的接 种环 取 MkTTn 肉 汤和 SC 增菌 液各1 环，分 别划 线接 种于 一个 BS 琼 脂平 板和 一个 XLD 琼 脂平 板(或 HE 琼 脂 平板或 沙门 氏菌 属显 色培 养基平 板)，于36 1 培养40 h 48 h(BS 琼脂平板)或18 h 24 h(XLD 琼脂 平板、HE 琼脂 平板、沙门氏 菌属 显色 培养 基平 板)，观察 各个 平板 上生长的菌 落，根据 菌落 形态 初步判 定典 型和 可疑 菌落，沙门 氏菌 在各 种选 择性 琼脂平 板上 的菌 落特 征 见 表2。根据菌 落 形 态挑 取5 个典型或 可疑 菌落（少于5 个时，全部挑 取），分 别 划 线接 种 于营养 琼脂 平皿 进行 分离 纯化，36 1 培养18 h 24 h。DB15/T 1848 2020 5 表2 沙门氏 菌属 在不 同选 择性 琼脂平 板上 的菌 落特 征 选择性琼脂平板 沙门氏菌菌落形态 BS 琼脂 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基无变化。HE 琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基 依据显色培养基的说明书判定。7.4 鉴定 7.4.1 染色镜检 沙 门氏 菌为 革兰 氏阴 性小杆 菌，无芽 胞,一般 无 荚膜，直径 约为0.6 m 1 m。7.4.2 生化鉴定 挑 取纯 培养 的菌 落进 行沙门 氏菌 生化 鉴定，具 体 操作依 据沙 门氏 菌生 化鉴 定试剂 说明 书或 见附 录B。7.4.3 辅助设 备鉴 定 可根据 实验 室情 况，选用 全 自动微 生物 生化 鉴定 系统 或飞行 时间 质谱 仪等 对典 型或可 疑菌 落进 行鉴定，具 体操 作依 据标 准GB/T 33682 和设 备操 作规 范 进行。7.4.4 血清学 鉴定 沙门氏 菌生 化试 验、全自 动生化 鉴定 系统 或飞 行质 谱仪鉴 定为 阳性 的菌 株，进行血 清学 鉴定。7.4.4.1 自凝性 检查 先在洁 净的 玻片 上滴 加一 滴生理 盐水，挑 取适 当大 小的纯 菌落（用 于纯 培养 的营养 琼脂 琼脂 含量 为1.2%1.5%）混 合于 生 理盐水 滴内，使 其成 为均 一的混 浊悬 液（轻度 乳浊），将玻 片轻 轻摇 动1 min 2 min，在 黑色 背景 下观 察 反应，若出 现可 见白 色的 菌体凝 集块，即 为有 自凝 性，反 之为 无自 凝性。对无自凝 性的 培养 物进 一步 进行血 清学 鉴定。7.4.4.2 多价菌 体抗 原(O)鉴定 用 O 抗原 进行 鉴定，具 体 操作同7.4.4.1，任 何程 度 的凝集 现象 皆为 阳性 反应。O 血 清不 凝 集时，将菌株 接种 在琼 脂量 较高 的（如2%3%）培 养基 上 培养后 再鉴 定；如果 是由 于Vi 抗 原的 存在 而阻 止了O抗原 凝集 反应 时，可挑 取 菌苔于1 mL 生理 盐水 中制 成浓菌 液，于酒 精灯 火焰 上煮沸 后再 鉴定。7.4.4.3 多价鞭 毛抗 原(H)鉴定 操作同 7.4.4.1，任 何程 度的凝 集现 象皆 为阳 性反 应。H 抗原 发育 不良 时，将菌株 接种 在0.55%0.65%半固 体琼 脂平 板的 中央，待菌 落蔓 延生 长时，取其 边缘 菌进 行鉴 定。DB15/T 1848 2020 6 7.4.4.4 表面 抗 原（Vi）鉴定 用 Vi 抗原 进行 鉴定，具 体操作 同 7.4.4.1，任 何 程度的 凝集 现象 皆为 阳性 反应。已 知具 有 Vi 抗原的菌 型有 伤寒 沙门 氏菌、丙型 副伤 寒沙 门氏 菌和 都柏林 沙门 氏菌。8 结果与 报告 8.1 沙门氏 菌生 化试 验、全自 动生化 鉴定 系统 或飞 行质 谱仪鉴 定为 阳性 的菌 株，同时血 清学 鉴定 结果为阳性，报 告动 物垫 料样 品中检 出沙 门氏 菌。8.2 沙门氏 菌生 化试 验、全自 动生化 鉴定 系统 或飞 行质 谱仪鉴 定为 阴性 的菌 株，报告动 物垫 料样 品中未检出 沙门 氏菌。9 生物安 全措 施 为了保 护实 验室 人员 安全，应 由具 备资 格的 工作 人 员检测 致病 菌，所 有培 养 物应小 心处 置，应 按照GB 19489 的 有关 规定 执行。10 废弃物 处理 和防 治污 染的 措施 检测过 程中 的废 弃物 需经121 高压 灭菌 处理 至少30 min 后 再弃 置。DB15/T 1848 2020 7 A A 附 录 A（规范 性附 录）培养基 和试 剂 A.1 培养基 制备 及质 量保 证 按照SN/T 1538.1 和SN/T 1538.2 执 行，并对 制备 好的 培养基 进行 性能 测试，如 使用等 效的 脱水 合成培养基，使 用前 对其 进行 验收并 按其 说明 书使 用。A.2 缓冲蛋 白胨 水(BPW)A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢 二钠(含12 个 结晶 水)9.0 g 磷酸二 氢钾 1.5 g 蒸馏水 1000 mL A.2.2 制法 将各成 分加 入蒸 馏水 中，搅 混均匀，静 置约10 min，煮 沸溶解，调 节pH至7.2 0.2，高压 灭菌121，15 min。A.3 MkTTn 肉汤 A.3.1 基础液 酪胨 8.6 g 牛肉粉 4.3 g 氯化钠 2.6 g 硫代硫 酸钠 30.5 g 碳酸钙 38.7 g 牛胆盐 4.78 g 煌绿 0.0096 g 新生霉 素 0.04 g 蒸馏水 1000 mL 除碳酸 钙外，将 各成 分加 入蒸馏 水中，煮 沸溶 解，再加入 碳酸 钙，调节pH至8.2 0.2，摇匀 煮沸 灭菌。DB15/T 1848 2020 8 A.3.2 硫代硫 酸钠 溶液 硫代硫 酸钠(含5 个结 晶水)50.0 g 蒸馏水 加至100 mL 高压灭 菌 121，20 min。A.3.3 0.5%煌绿 水溶 液 煌绿 0.5 g 蒸馏水 100 mL 溶解后，存 放暗 处，不少 于1 d，使 其自 然灭 菌。A.3.4 牛胆盐 溶液 牛胆盐 10.0 g 蒸馏水 100 mL 加热煮 沸至 完全 溶解，121 高 压灭 菌20 min。A.3.5 制法 基础液 900 mL 硫代硫 酸钠 溶液 100 mL 煌绿水 溶液 2.0 mL 牛胆盐 溶液 50.0 mL 临用前，按 上列 顺序，以 无菌操 作依 次加 入基 础液 中，每 加入 一种 成分，均 应摇匀 后再 加入 另一 种成分。A.4 亚硒酸 盐胱 氨酸(SC)增菌 液 A.4.1 成分 蛋白胨 5.0 g 乳糖 4.0 g 磷酸氢 二钠 10.0 g 亚硒酸 氢钠 4.0 g L-胱氨 酸 0.01 g 蒸馏水 1000 mL A.4.2 制法 除亚硒 酸氢 钠和L-胱 氨酸 外，将 各成 分加 入蒸 馏水 中，煮 沸溶 解，冷至55 以下，以无 菌操 作加入亚硒 酸氢 钠和1 g/L L-胱 氨酸溶 液10mL(称取0.1 g L-胱氨 酸，加1 mol/L 氢氧 化钠溶 液15 mL，溶 解，再加无 菌蒸 馏水 至100 mL 即成，如为DL-胱氨 酸，用 量应加 倍)。摇 匀，调节pH 至7.0 0.2。A.5 亚硫酸 铋(BS)琼脂 DB15/T 1848 2020 9 A.5.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉 膏 5.0 g 葡萄糖 5.0 g 硫酸亚 铁 0.3 g 磷酸氢 二钠 4.0 g 煌绿 0.025 g 或5.0 g/L 水溶 液5.0 mL 柠檬酸 铋铵 2.0 g 亚硫酸 钠 6.0 g 琼脂 18.0 g 20.0 g 蒸馏水 1000 mL A.5.2 制法 将前三 种成 分加 入300 mL 蒸馏水(制 作基 础液)，硫 酸亚铁 和磷 酸氢 二钠 分别 加入20 mL 和30 mL 蒸馏水中，柠檬 酸铋 铵和 亚硫 酸钠分 别加 入另 一20 mL 和30 mL 蒸馏 水中，琼 脂加 入600 mL 蒸 馏水 中；然后 分别搅拌 均匀，煮 沸溶 解。冷至80 左右 时，先将 硫 酸亚铁 和磷 酸氢 二钠 混匀，倒入 基础 液中，混 匀。将柠檬 酸铋 铵和 亚硫 酸钠 混匀，倒入 基础 液中，再 混匀。调节pH至7.5 0.2，随即 倾入 琼脂 液 中，混合均 匀，冷至50 55。加入 煌绿 溶液，充 分 混匀后 立即 倾注 平皿。注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过48 h 会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。A.6 HE 琼脂(Hektoen Enteric Agar)A.6.1 成分 蛋白胨 12.0 g 牛肉膏 3.0 g 乳糖 12.0 g 蔗糖 12.0 g 水杨素 2.0 g 胆盐 20.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 18.0 g 20.0 g 蒸馏水 1000 mL 0.4%溴麝 香草 酚蓝 溶液 16.0 mL Andrade 指 示剂 20.0 mL 甲液 20.0 mL 乙液 20.0 mL A.6.2 制法 将前面 七种 成分 溶解 于400 mL 蒸 馏水 内作为 基础 液；将琼脂 加入 于600 mL 蒸馏 水内。然后 分别 搅拌均匀，煮沸 溶解。加 入甲 液和乙 液于 基础 液内，调 节pH 至7.5 0.2。再加 入 指示剂 并与 琼脂 液合 并，待冷至50 55 倾注 平皿。DB15/T 1848 2020 10 注1：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。注2：甲液的配制 硫代硫 酸钠 34.0 g 柠檬酸 铁铵 4.0 g 蒸馏水 100 mL 注3：乙液的配制 去氧胆 酸钠 10.0 g 蒸馏水 100 mL 注4：Andrade 指示剂 酸性复 红 0.5 g 1mol/L 氢氧 化钠 溶液 16.0 mL 蒸馏水 100 mL 将复红 溶解 于蒸 馏水 中，加入氢 氧化 钠溶 液。数小 时后如 复红 褪色 不全，再 加氢氧 化钠 溶液1 mL 2 mL。A.7 木糖赖 氨酸 脱氧 胆盐(XLD)琼脂 A.7.1 成分 酵母膏 3.0 g L-赖氨 酸 5.0 g 木糖 3.75 g 乳糖 7.5 g 蔗糖 7.5 g 去氧胆 酸钠 2.5 g 柠檬酸 铁铵 0.8 g 硫代硫 酸钠 6.8 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g 酚红 0.08 g 蒸馏水 1000 mL A.7.2 制法 除酚红 和琼 脂外，将其 他 成分加 入400 mL 蒸馏 水中，煮 沸溶 解，调 节pH 至7.4 0.2。另将 琼脂 加入600 mL 蒸馏 水中，煮 沸溶 解。将上述 两溶 液混 合均 匀后，再加 入指 示剂，待 冷至50 55 倾 注平 皿。注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。A.8 三糖铁(TSI)琼脂 DB15/T 1848 2020 11 A.8.1 成分 蛋白胨 20.0 g 牛肉膏 5.0 g 乳糖 10.0 g 蔗糖 10.0 g 葡萄糖 1.0 g 硫酸亚 铁铵(含6 个结 晶 水)0.2 g 酚红 0.025 g 或5.0 g/L溶液5.0 mL 氯化钠 5.0 g 硫代硫 酸钠 0.2 g 琼脂 12.0 g 蒸馏水 1000 mL A.8.2 制法 除酚红 和琼 脂外，将其 他 成分加 入400 mL 蒸馏 水中，煮 沸溶 解，调 节pH 至7.4 0.2。另将 琼脂 加入600 mL 蒸馏 水中，煮 沸溶 解。将上述 两溶 液混 合均 匀后，再加 入指 示剂 混匀，分 装试管，每 管约2 mL 4 mL，高压 灭菌121 10 min或115 15 min，灭 菌后制 成高 层斜 面，呈桔 红色。A.9 蛋白胨 水、靛基 质试 剂 A.9.1 蛋白胨 水 蛋白胨 或胰 蛋白 胨 20.0 g 氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1000 mL 将上述 成分 加入 蒸馏 水中，煮沸 溶解，调 节pH 至7.4 0.2，分 装小 试管，121 高压 灭菌15 min。A.9.2 靛基质 试剂 A.9.2.1 柯凡克 试剂 将5 g 对二 甲氨 基甲 醛溶 解 于75 mL 戊 醇中，然 后缓 慢 加入浓 盐酸25 mL。A.9.2.2 欧-波 试剂 将1 g 对二 甲氨 基苯 甲醛 溶 解于95 mL 95%乙 醇内，然后缓 慢加 入浓 盐酸20 mL。A.9.3 试验方 法 挑取小 量培 养物 接种，在36 1 培养1 d 2 d，必要 时可 培养4 d 5 d。加入 柯凡 克试 剂约0.5 mL，轻 摇试 管，阳性 者于试 剂层 呈深 红色；或 加入欧-波 试剂 约0.5 mL，沿管壁 流下，覆 盖于 培养液表面，阳 性者 于液 面接 触处呈 玫瑰 红色。注：蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。DB15/T 1848 2020 12 A.10 尿素琼 脂(pH7.2)A.10.1 成分 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 5.0 g 葡萄糖 1.0 g 磷酸二 氢钾 2.0 g 0.4%酚红 3.0 mL 琼脂 20.0 g 蒸馏水 1000 mL 20%尿 素溶 液 100 mL A.10.2 制法 除尿素、琼 脂和酚 红外，将其他 成分 加入400 mL 蒸 馏水中，煮 沸溶解，调 节pH 至7.2 0.2。另 将琼脂加入600 mL 蒸 馏水 中，煮沸溶 解。将上述 两溶 液混 合均 匀后，再 加入 指示 剂后 分装，121 高压 灭菌15 min。冷 至50 55，加入经除 菌过 滤的 尿素 溶液。尿素 的最 终浓 度为2%。分装于 无菌 试管 内，放成 斜面备 用。A.10.3 试验方 法 挑取琼 脂培 养物 接种，在36 1 培养24 h，观 察结果。尿 素酶 阳性 者由 于产碱 而使 培养 基变为红色。A.11 氰化钾(KCN)培 养基 A.11.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸二 氢钾 0.225 g 磷酸氢 二钠 5.64 g 蒸馏水 1000 mL 0.5%氰化 钾 20.0 mL A.11.2 制法 将除氰 化钾 以外 的成 分加 入 蒸馏 水中，煮 沸溶 解，分装后121 高 压灭 菌15 min。放在 冰箱 内使 其充分冷 却。每100 mL 培 养 基加入0.5%氰 化钾 溶液2.0 mL(最后 浓度 为1:10000)，分装 于无 菌试 管内，每管约4 mL 立 刻用 无菌 橡皮 塞塞紧，放 在4 冰 箱内，至少 可保 存两 个月。同 时将不 加氰 化钾 的培 养 基 作为对照 培养 基，分装 试管 备用。A.11.3 试验方 法 将琼脂 培养 物接 种于 蛋白 胨水内 成为 稀释 菌液，挑 取1环 接种 于氰 化钾(KCN)培养基。并 另挑 取1 环接种于 对照 培养 基。在36 1 培 养1 d 2 d，观察结 果。如有 细菌 生长 即为阳 性(不抑 制)，经2 d细菌不 生长 为阴 性(抑制)。DB15/T 1848 2020 13 注：氰化钾是剧毒药，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏 天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应，试验时对每一环节都要特别注意。A.12 赖氨酸 脱羧 酶试 验培 养基 A.12.1 成分 蛋白胨 5.0 g 酵母浸 膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 蒸馏水 1000 mL 1.6%溴 甲酚 紫-乙醇 溶液 1.0 mL L-赖氨酸 或DL-赖 氨酸 0.5 g/100 mL 或1.0 g/100 mL A.12.2 制法 除赖氨 酸以 外的 成分 加热 溶解后，分 装每 瓶100 mL，分别 加入 赖氨 酸。L-赖 氨酸按0.5%加入 DL-赖氨酸 按1%加 入。调 节pH 至6.8 0.2，对 照培 养基 不加赖 氨酸。分 装于 无菌 的小试 管内，每 管0.5 mL，上面滴 加一 层液 体石 蜡，115 高压 灭菌10 min。A.12.3 试验方 法 从琼脂 斜面 上挑 取培 养物 接种，于36 1 培 养18 h24 h，观 察结 果。氨基酸 脱羧 酶阳 性者由于产 碱，培养 基应 呈紫 色。阴 性者 无碱 性产 物，但因葡 萄糖 产酸 而使 培养 基变 为 黄色。对 照管 应 为 黄色。A.13 糖发酵 管 A.13.1 成分 牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 3.0 g 磷酸氢 二钠(含12 个 结晶 水)2.0 g 0.2%溴麝 香草 酚蓝 溶液 12.0 mL 蒸馏水 1000 mL A.13.2 制法 A.13.2.1 葡萄糖 发酵管 按上 述成分 配好后，调节pH至7.4 0.2。按0.5%加 入葡萄 糖，分装于 有一 个倒置小 管的 小试 管内，121 高 压灭 菌15 min。A.13.2.2 其他各 种糖 发酵 管可 按上 述成分 配好 后，分 装每 瓶100 mL，121 高压 灭菌15 min。另 将各种糖类 分别 配好10%溶液，同 时高 压灭 菌。将5 mL 糖溶液 加入 于100 mL 培养 基内，以 无菌 操作 分装 小 试管。注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。DB15/T 1848 2020 14 A.13.3 试验方 法 从琼脂 斜面 上挑 取小 量培 养物接 种，于36 1 培养，一般2 d 3 d。迟 缓反应 需观 察14 d 30 d。A.14 邻硝基 酚-D 半乳 糖苷(ONPG)培 养基 A.14.1 成分 邻硝基 酚-D半 乳糖 苷(ONPG)60.0 mg 0.01 mol/L 磷酸 钠缓 冲液(pH7.5)10.0 mL 1%蛋 白胨 水(pH 7.5)30.0 mL A.14.2 制法 将ONPG 溶于 缓冲 液内，加 入蛋白 胨水，以过 滤法 除 菌，分 装于 无菌的 小试 管 内，每 管0.5 mL，用 橡皮塞塞 紧。A.14.3 试验方 法 自琼脂 斜面 上挑 取培 养物1 满环接 种于36 1 培养1 h 3 h 和24 h 观 察结 果。如 果-半 乳糖苷酶产 生，则于1 h 3 h 变黄色，如 无此 酶则24 h 不变色。A.15 半固体 琼脂 A.15.1 成分 牛肉膏 0.3 g 蛋白胨 1.0 g 氯化钠 0.5 g 琼脂 0.35 g 0.4 g 蒸馏水 100 mL A.15.2 制法 按以上 成分 配好，煮 沸溶 解，调 节pH 至7.4 0.2。分装小 试管121 高 压灭 菌15 min。直立 凝固备用。注：供动力观察、菌种保存、H 抗原位相变异试验等用。A.16 丙二酸 钠培 养基 A.16.1 成分 酵母浸 膏 1.0 g 硫酸铵 2.0 g 磷酸氢 二钾 0.6 g 磷酸二 氢钾 0.4 g 氯化钠 2.0 g DB15/T 1848 2020 15 丙二酸 钠 3.0 g 0.2%溴麝 香草 酚蓝 溶液 12.0 mL 蒸馏水 1000 mL A.16.2 制法 除指示 剂以 外的 成分 溶解 于水，调节pH 至6.8 0.2，再加 入指 示剂，分 装试 管121 高 压灭 菌15 min。A.16.3 试验方 法 用新鲜 的琼 脂培 养物 接种，于36 1 培 养48 h，观察 结果，阳 性者 由绿 色变为 蓝色。A.17 无菌生 理盐 水 A.17.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 mL A.17.2 制法 氯化钠加 入1000 mL 蒸馏水中，搅拌 至完全 溶解，分装 后，121 灭菌15 min，备用。DB15/T 1848 2020 16 B B 附 录 B（规范 性附 录）生化试 验 自选择 性琼 脂平 板上 分别 挑取5 个以 上典 型或 可疑 菌 落接种 三糖 铁琼 脂，先在 斜面划 线再 于底 层穿刺；接 种针 不要 灭菌，直 接接种 赖氨 酸脱 羧酶 试验 培养基 和营 养琼 脂平 板，于36 1 培养18 h 24 h，必要 时可 延长 至48 h。在三 糖铁 琼脂 和赖 氨酸 脱羧酶 试验 培养 基内，沙 门氏菌 属的 反应 结果 见表B.1。表B.1 沙门氏 菌属 在三 糖铁 琼脂 和赖氨 酸脱 羧酶 试验 培养 基内的 反应 结果 三塘铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验培养基 初步判断 斜面 底层 产气 硫化氢 K A+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属 K A+(-)+(-)-可疑沙门氏菌属 A A+(-)+(-)+可疑沙门氏菌属 A A+/-+/-非沙门氏菌 K K+/-+/-+/-非沙门氏菌 注：K：产碱，A：产酸；+：阳性，-：阴性；+(-)：多数阳性，少数阴性；+/-：阳性或阴性。B.1.1 沙门氏 菌属 生化 反应 初步 鉴别 接种三 糖铁 琼脂 和赖 氨酸 脱羧酶 试验 培养 基的 同时，可直 接接 种蛋 白胨 水(供 做靛 基 质试 验)、尿 素琼脂(pH7.2)、氰 化钾(KCN)培养基，也 可在 初步 判断 结 果后从 营养 琼脂 平板 上挑 取可疑 菌落 接种。于36 1 培养18 h 24 h，必 要时可 延长 至48 h，按表B.2 判定 结果。将 已挑 菌落 的 平板储 存于2 5 或室温 至少 保留24 h，以 备必要 时复 查。表B.2 沙门氏 菌属 生化 反应 初步 鉴别表 序号 硫化氢 靛基质 pH7.2 尿素 氰化钾(KCN)赖氨酸脱羧酶 A1+-+A2+-+A3-+/-注：+阳性，-阴性；+/-阳性或阴性。DB15/T 1848 2020 17 B.1.2 反应序 号A1 典型反 应判 定为 沙门 氏菌 属，如尿 素、KCN 和赖 氨 酸脱羧 酶3 项中 有1项 异常，按 表B.3 可 判定 为沙门氏菌；如 有2 项异 常为 非 沙门氏 菌。表B.3 沙门氏 菌属 生化 反应 判定 表 pH7.2 尿素 氰化钾(KCN)赖氨酸脱氢酶 判定结果-甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）-+沙门氏菌或（要求符合本群生化特性）+-+沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）注：+表示阳性；-表示阴性。B.1.3 反应序 号A2 2项异常 补做 甘露醇 和山梨 醇试验，沙门 氏菌 靛基质 阳性变 体两项 试验 结果均 为 阳性 但需要 结合 血清学鉴 定结 果进 行判 定。B.1.4 反应序 号A3 2项异常补做ONPG，ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖 氨酸脱羧酶阳性，甲型副 伤寒沙门氏菌为赖 氨酸脱羧 酶阴 性。B.1.5 必要时 按表B.4 进行 沙门 氏菌生 化群 鉴别。表B.4 沙门氏 菌属 各生 化群 的鉴 别 11 项目名称 卫矛醇+-+-山梨醇+-水杨苷-+-ONPG-+-+-丙二酸盐-+-KCN-+-注：+表示阳性；-表示阴性。DB15/T 1848 2020 18 C C 附 录 C（规范 性附 录）沙门氏 菌常 用培 养基 与试 剂灭菌 后保 存期 限 表C.1 沙门氏 菌常 用培 养基 与试 剂灭菌 后保 存期 限 名 称 保存期限 保存条件 缓冲蛋白胨水（BPW）6 个月 5 四硫磺酸钠新生霉素增菌液（MKTTn）4 周 5，避光 亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）直至出现红色沉淀 5 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板（XLD）4 周 5，防干燥 亚硫酸铋琼脂平板(BS)24 h 室温，避光 HE 琼脂平板 24 h 室温，干燥 沙门氏菌显色培养基平板 5 d 5，避光 营养琼脂平板（NA）4 周 5，防干燥 三糖铁斜面琼脂（TSI）4 周 5，防干燥 尿素琼脂（UA）4 周 5，防干燥 赖氨酸脱羧酶试验培养基 3 个月 5 _