鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范DB37／T 3821-2019.pdf

ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3821 2019 鸭新型呼 肠孤病毒 病诊断技 术规范 Diagnostic techniques for novel duck reovirus disease 2019-12-24 发布 2020-01-24 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 3821 2019 I 前 言 GB/T 1.1 2009 DB37/T 3821 2019 1 鸭 新型呼 肠孤病毒 病诊断 技术规范 1 范围 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB 19489 NY/T 541 3 术语和 定义 3.1 鸭新型 呼肠 孤病 毒病 4 临床诊 断 4.1 流行病 学 5 25 5 10 5 7 4.2 临床症 状 5%35%20%4.3 病理变 化 4.4 结果判 定 DB37/T 3821 2019 2 4.1 4.2 4.3 5 实验室 诊断 GB/T 6682 GB 19489 5.1 病原分 离鉴 定 5.1.1 仪器和 设备 5.1.1.1 5.1.1.2 5.1.2 试剂或 材料 5.1.2.1 10 000 IU/mL 10 000 g/mL 5.1.2.2 0.22 m 5.1.2.3 8 9 5.1.3 病料处 理 NY/T 541 1 g 2 g 10 2 000 IU/mL 2 3 8 000 g 20 min 0.22 m 5.1.4 操作步 骤 5.1.4.1 5.1.3 8 9 0.1 mL/5 37 6 5.1.4.2 24 h 6 5.2 5.3 5.4 6 6 5.2 5.3 5.4 5.1.5 结果判 定 5.1.5.1 6 5.2 5.3 5.4 5.1.5.2 6 5.2 5.3 5.4 5.2 RT-PCR 方法 5.2.1 仪器和 设备 5.2.1.1 5.2.1.2 PCR 5.2.1.3 DB37/T 3821 2019 3 5.2.1.4 5.2.2 试剂或 材料 5.2.2.1 TRIZol 5.2.2.2 RNA 5.2.2.3 M-MLV 5.2.2.4 RNA 5.2.2.5 Taq 5.2.2.6 5.2.2.7 Goldview DNA 5.2.2.8 5.2.2.9 5.2.3 操作步 骤 5.2.3.1 样品处 理 NY/T 541 1 g 2 g 10 2 3 8 000 g 10 min 100 L RNA 5.2.3.2 RNA 提取 5.2.3.2.1 100 L 1 mL TRIZol 50 100 10 min 200 L 50 100 5 min 10 min 12 000 g 10 min 5.2.3.2.2 50 100 12 000 g 10 min 5.2.3.2.3-20 30 min 12 000 g 15 min 20 min 5.2.3.2.4 1 mL 75%12 000 g 5 min 10 min 5.2.3.2.5 12 000 g 5 min 5.2.3.2.6 20 L RNA RNA RNA 5.2.3.3 引物 P1 5 TCATTCATTTGGGCAGCGG 3 P2 5 AGTAGTGTGTAAAGCATGGACT 3 5.2.3.4 RT-PCR 扩增 5.2.3.4.1 反转录（RT）反 应 10 L PCR P2(20 PCR 70 5 min 1 min 2 min RNA M-5 M-PCR 42 30 min 95 2 min 5.2.3.4.2 PCR 扩增 5.2.3.4.2.1 反应体 系 DB37/T 3821 2019 4 50 L 1 表1 PCR 反 应体 系配 制 4.5 20 P1 0.5 20 P2 0.5 RT 5.0 5 Taq E 0.5 ddH2O 39.0 50.0 5.2.3.4.2.2 反应程 序 95 3 min 95 20 s 55 20s 72 30 s 30 72 10 min RT-PCR RT-PCR 5.2.3.5 电泳 PCR 6 10 1.5%2 000 bp Ladder Marker 5 V/cm 25 min 30 min 5.2.4 结果判 定 5.2.4.1 试验成 立条 件 226 bp 5.2.4.2 结果判 定 A 5.3 荧光 RT-PCR 方法 5.3.1 仪器与 设备 5.3.1.1 5.3.1.2 PCR 5.3.2 试剂或 材料 5.3.2.1 TRIZol 5.3.2.2 RNA 5.3.2.3 SYBR Green RT-PCR 2 SYBR Premix DB37/T 3821 2019 5 5.3.2.4 5.3.2.5 5.3.3 操作步 骤 5.3.3.1 样品处 理 5.2.3.1 5.3.3.2 RNA 提取 5.2.3.2 5.3.3.3 引物 P3 5 ATCGCACTATTGACGCACTT 3 P4 5 TTGACGACGCCAATCCC 3 5.3.3.4 荧光 RT-PCR 扩增 5.3.3.4.1 反转录（RT）反 应 5.2.3.4.1 5.3.3.4.2 荧光PCR 5.3.3.4.2.1 反应体 系 25.0 2 表2 荧光 PCR 反 应体 系配 制 12.5 20 P3 0.5 20 P4 0.5 RT 1.0 ddH2O 10.5 25.0 5.3.3.4.2.2 反应程 序 95 45 s 95 10 s 56 10 s 72 15 s 40 72 RT-PCR Real-time RT-PCR Ct 5.3.4 结果判 定 5.3.4.1 试验成 立条 件 DB37/T 3821 2019 6 Ct 33 Ct 35 5.3.4.2 结果判 定 Ct 33 Ct Ct 35 Ct 33-35 Ct 35 B 5.4 RT-LAMP 方法 5.4.1 仪器与 设备 5.4.1.1 5.4.1.2 5.4.1.3 5.4.2 试剂或 材料 5.4.2.1 TRIZol 5.4.2.2 RNA 5.4.2.3 betaine 5.4.2.4 TritonX-100 5.4.2.5 AMV 5.4.2.6 RNA 5.4.2.7 Bst DNA 5.4.2.8 SYBR Green 5.4.2.9 5.4.2.10 5.4.3 操作步 骤 5.4.3.1 样品处 理 5.2.3.1 5.4.3.2 RNA 提取 5.2.3.2 5.4.3.3 引物 RT-LAMP 3 表3 RT-LAMP 引 物序 列-NDR-F3 TGAGATATATTAGGGTGGGTC NDR-B3 GACATGCCTAGTATGGAGCAT NDR-FIP agcgatatcctgaggttgctTTTGCCATTGCTCTGCATGTC NDR-BIP aggcgaggatatgacgc TTTTCATCGATCATCTTCCAACCC DB37/T 3821 2019 7 5.4.3.4 RT-LAMP 扩增 5.4.3.4.1 反应体 系 25.0 L 4 表4 RT-LAMP 反 应体 系配 制 PCR 2.5 10 mmol/L dNTP 1.0 25 mmol/L MgCl2 3.0 5 mol/L Betaine 2.0 10 NDR-F3 0.5 10 NDR-B3 0.5 40 NDR-FIP 1.0 40 NDR-BIP 1.0 40 1.0 5 AMV 1.0 8 1.0 RNA 5.0 RNA 5.5 25.0 5.4.3.4.2 反应程 序 63 45 min 85 2 min 5.4.4 结果判 定 5.4.4.1 试验成 立条 件 1 L 10 SYBR Green 5.4.4.2 结果判 定 C 6 综合判 定 5.2 5.3 5.4 DB37/T 3821 2019 8 A A 附 录 A（资料 性附 录）RT-PCR 结 果电 泳图 RT-PCR A.1 M DNA Marker DL2000 1 2 1 3 2 4 图A.1 RT-PCR 结 果电 泳图 DB37/T 3821 2019 9 B B 附 录 B（资料 性附 录）典型扩 增曲 线示 意图 B.1 1 2 1 3 2 4 图B.1 典型扩 增曲 线示 意图 DB37/T 3821 2019 10 C C 附 录 C（资料 性附 录）RT-LAMP 结 果示 意图 RT-LAMP C.1 1 2 1 3 2 4 图C.1 RT-LAMP 结 果示 意图 _