番茄灰霉病诊断与防治技术规程DB22／T 3193-2020.pdf

ICS 65.020 B 05 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 31932020 番茄灰霉病诊断与防治技术规程 Code of practice for diagnosis and control against tomato grey mold 2020-11-23发布 2020-12-30实施吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 31932020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：吉林农业大学。本文件的主要起草人：王晓梅、陶淑霞、孙周平、赵秀香、曹国先、崔四川、曲梦楠、赵子健、王瑶、张丹。DB22/T 31932020 1 番茄灰霉病诊断与防治技术规程 1 范围 本文件规定了番茄灰霉病的病害诊断与防治技术。本文件适用于番茄灰霉病的病害诊断、病原鉴定和综合防治。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 8321（所有部分）农药合理使用准则 NY/T 1276 农药安全使用规范 总则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 番茄灰霉病 tomato gray mold 由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.ex Fr.）侵染番茄引起的一种真菌性病害。3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction，PCR 是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法。4 番茄灰霉病诊断与防治技术程序的构成 番茄灰霉病诊断与防治技术程序主要包括以下几个阶段，程序流程图如图 1 所示。图1 DB22/T 31932020 2 5 病害诊断 5.1 症状诊断 5.1.1 茎叶症状 叶片染病，多从叶尖开始，病斑呈“V”字形向内扩展，初期呈水渍状，浅褐色，有不明显的深浅相间轮纹，潮湿时，病斑表面生有灰色霉层；茎部染病，多发生在分枝处或基部，初期产生水渍状小点，后迅速扩展成长椭圆形，潮湿时，表面会有灰色霉层，茎部染病严重的可以绕茎一周，病枝易折断，有时病部以上植株枯死。典型症状见附录 A.1。5.1.2 花果症状 花上染病，病菌多从柱头和花瓣侵入，潮湿时，病部会有灰色霉层；幼果染病，多从果柄向果面扩展，在果柄附近形成灰褐色至黄褐色坏死斑，空气湿润时果面上会有灰色霉层，后期会引起花瓣、果实腐烂。典型症状见附录 A.1。5.2 病原诊断 5.2.1 显微观察 在普通光学显微镜 1010 倍下进行形态观察，病菌的孢子梗数根丛生，褐色，顶端具 1 次2 次分枝，分枝顶端密生小柄，其上生大量分生孢子。分生孢子圆形至椭圆形，单细胞，近无色，大小(5.5 m16 m)(5.0 m9.25 m)，分生孢子梗(811.8 m1772.1 m)(11.8 m19.8 m)。病原菌形态图见附录 A.2。5.2.2 分子检测 5.2.2.1 单孢分离 采集具有典型灰霉病病斑的番茄病叶，用毛刷刷取叶片上的孢子于盛有无菌水的烧杯中，采用稀释 平板法，挑取单个孢子，放置 PDA 培养基上培养，27 条件下黑暗培养 3 d，待产孢后镜检，初步确定为灰葡萄孢后进行菌丝扩繁培养。5.2.2.2 DNA提取 采用 CTAB 法，提取病菌基因组 DNA。具体方法按附录 B.1 的要求执行。5.2.2.3 PCR扩增 以基因组 D N A 为模板，采用通用引物 ITS4/ITS5（ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3/ITS5：5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）对病原物 ITS 区域扩增，PCR 反应参数按附录 B.2 的要求执行。PCR 产物送交生物技术公司进行测序。5.2.2.4 BLAST比对 测序结果在 GenBank 中进行 BLAST 比对分析，确定为灰葡萄孢菌。6 综合防治 6.1 防治原则 DB22/T 31932020 3 病害防治应采取“预防为主，综合防治”的原则，在选用抗病品种的基础上，加强栽培管理，结合生态防控和化学防控进行病害综合治理。6.2 防治方法 6.2.1 农业防治 6.2.1.1 品种选择 选用优质、耐病、株型紧凑的番茄品种。6.2.1.2 清洁田园 定植前彻底清理前茬作物的残株、烂叶和杂草等；在棚内多处用硫磺粉，每亩 2 kg3 kg，拌上锯末分多处点燃，密闭 24 h 后通风排味。6.2.1.3 土壤消毒 对土壤采用生石灰消毒，每亩 80 kg100 kg，整地时深翻入土壤 20 cm，浇透水，一周后可以定植栽培。6.2.1.4 合理轮作 与非茄科作物进行 5 年以上轮作。6.2.1.5 田间管理 番茄坐果后及时去除残留的花瓣；及时疏花疏果、整枝打杈。6.2.2 生态防控 6.2.2.1 降低湿度 在温度允许条件下，白天注意通风降湿，相对湿度控制在 60%以下，夜间相对湿度控制在 85%以下。采用农膜下软管滴灌或沟灌，要小水勤浇，避免大水漫灌，减少地上部湿度，有效控制肥水。6.2.2.2 调控温度 温度白天保持在 25 28，夜温不低于 18 15，地温不低于 15。6.2.2.3 增加光照 选用透光率高的 PO 膜，保持薄膜表面清洁，提高透光率；二层幕昼开夜闭。6.2.3 化学防控 6.2.3.1 原则 药剂使用应符合 GB/T 8321（所有部分）和 NY/T 1276 的规定，不同机制杀菌剂应交替使用，严格按照农药安全间隔期采收。药剂管理按附录 C 要求执行。6.2.3.2 方法 6.2.3.2.1 熏蒸法 DB22/T 31932020 4 可选用 10%腐霉利烟剂、15%腐霉百菌清烟剂、15%异菌百菌清烟剂点燃防病。傍晚点燃，闭棚过夜，次日早晨通风，隔 6 d 7 d 再熏 1 次。6.2.3.2.2 喷雾法 在病害发生前或发生初期，在保护地相对湿度较低时可以采用喷雾法进行病害预防或者治疗，喷雾要求均匀周到，不留死角。可选择使用的药剂种类及用量见表 1，用药方法参照说明书。表1 防治番茄灰霉病主要药剂种类及防治方法 序号 药剂名称及剂型 使用时期 用药量（亩）施用方法 使用次数（次）1 66%甲硫乙霉威WP 发病初期 56 g75 g 常规喷雾 23 2 48%菌核福美双WP 发病初期 75 g150 g 常规喷雾 23 3 25%菌核福美双WP 发病初期 60 g80 g 常规喷雾 23 4 50%克菌丹WP 发病前期 155 g190 g 常规喷雾 23 5 50%异菌脲WP 发病初期 75 g100 g 常规喷雾 23 6 50%啶酰菌胺WG 发病初期 40 g50 g 常规喷雾 23 7 30%啶酰咯菌腈SC 发病初期 45 mL60 mL 常规喷雾 23 8 38%唑醚啶酰菌SC 发病初期 40 mL50 mL 常规喷雾 23 9 500g/L氟吡菌酰胺嘧霉胺SC 发病初期 60 mL80 mL 常规喷雾 23 10 45%异菌脲氟啶胺SC 发病初期 40 mL50 mL 常规喷雾 23 11 22.5%啶氧菌酯SC 发病初期 26 mL36 mL 常规喷雾 23 12 40%甲硫福美双SC 发病初期 100 mL140 mL 常规喷雾 23 13 43%腐霉利SC 发病初期 100 mL120 mL 常规喷雾 23 14 30%咯菌腈SC 发病前期 9 mL12 mL 常规喷雾 23 a 异菌脲不能与腐霉利、乙烯菌核利等作用方式相同的杀菌剂混用或轮用。DB22/T 31932020 5 A A 附 录 A（资料性附录）番茄灰霉病病害症状图片及病原菌形态图片 A.1 病害症状 图A.1A.2 给出了番茄灰霉病不同发病部位典型症状。图A.1 叶上症状和茎上症状 图A.2 花上症状和果实症状 DB22/T 31932020 6 A.2 病原菌形态 图A.3A.4 给出了番茄灰霉病病原菌形态。图A.3 病原菌分生孢子、分生孢子梗和分生孢子小梗（手绘图片）图A.4 病原菌分生孢子、分生孢子梗和分生孢子小梗（显微图片）DB22/T 31932020 7 B B 附 录 B（规范性附录）CTAB 法提取病原菌基因组 DNA B.1 CTAB 法提取基因组 DNA 具体操作步骤 B.1.1 将清洗干净的研砵，研杵及药匙灭菌备用，配置好的CTAB提取液置于 65 水浴中预热；B.1.2 先加入少量灭菌的石英砂于适量扩繁的病菌菌丝体中迅速研磨后分装于离心管中，再加入事先预热的 CTAB 700 L，反复颠倒震荡，使其充分混溶，65 水浴 1 h，期间每隔 15 min 拿出颠倒摇匀一次，并开盖放气，防止因为气体受热膨胀而使盖子崩开；B.1.3 取出冷却后，加入等体积的苯酚氯仿，轻轻翻转，混匀后，常温离心 10 min(12000 rpm)；B.1.4 移取上清液至新离心管中，加入 2 倍体积的无水乙醇，轻轻转动离心管，使 DNA 沉淀，待白色絮状沉淀出现后，放置于-20 冰箱 30 min 以上，常温离心 10 min（8000 rpm）；B.1.5 弃上清液，吸取适量 75 的酒精于离心管中，轻轻摇匀，离心 5 min（8000 rpm），漂洗 2 次，晾干后，加适量TE缓冲液，4 溶解；B.1.6 用 1.5 的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA。B.2 PCR 反应体系和参数 B.2.1 反应体系 10PCR Buffer 为 5 L，25 mM MgCl2 加 1 L，10 mM dNTP 加 5 L，5u/LTaq DNA 酶加 2 L，模板 DNA 加 1.5 L，无菌双蒸水补足至 50 L。B.2.2 反应参数 B.2.2.1 94 预变性 5 min，94 变性 1 min，48.5 退火 50 s，72 延伸 1 min 共 35 个循环，72 温浴 10 min，4 保存；B.2.2.2 PCR 产物检测使用 0.8 的琼脂糖凝胶，用 0.5TBE 电泳缓冲液，100 V 电泳 3040 min；B.2.2.3 在凝胶成像系统进行电泳结果观察，判断是否为预扩增长度的条带，无非特异性条带，且浓度大于 50 ng/L；B.2.2.4 交由生物公司纯化并测序。DB22/T 31932020 8 C C 附 录 C（规范性附录）农药管理 C.1 采购 不得采购国家禁止使用的农药。应从正规渠道采购下列农药，并索取购药凭证或发票：有资质农药经营单位经营的农药；有农药登记证或农药临时登记证的农药；有农药生产许可证或农药生产批准文件的农药；有产品质量标准及合格证明的农药；标签内容完整的农药；保质期内的农药；国家和进口国允许使用的农药。C.2 贮存 应贮存于专用场所，由专人负责保管。场所应符合卫生、防火、防水、防雨、防腐、避光、阴凉、干燥、通风等安全条件要求，并配有农药配制量具、急救药箱，出入口处贴有警示标志。不得与食品、农产品、饮料、饲料等混放。C.3 包装物处理 农药包装物不能随意丢弃，也不可做他用。农药空包装物应清洗 3 次以上，空的农药包装物在回收处置前应妥善收集。_