番鸭胚垂直传播病毒(RT-)PCR检测技术规范DB34／T 3653-2020.pdf

ICS 65.020.30 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 36532020 番鸭胚垂直传播病毒(RT-)PCR检测 技术规范 Technical regulation for detection of vertical transmission viruses by(RT-)PCR from Muscovy Duck embryos 文稿版次选择 2020-06-22发布 2020-07-22实施安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 36532020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安庆永强农业科技股份有限公司提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安庆永强农业科技股份有限公司、福建省农业科学院畜牧兽医研究所、利辛县绿墅养殖专业合作社、安徽黄氏番鸭食品有限公司、阜阳市农业科学院。本标准主要起草人：刘荣昌、刘友生、蒋晓璐、汪敏、赵巧珍、傅秋玲、黄瑜、黄永强、万春和、郭大伟、傅光华、施少华、程龙飞。DB34/T 36532020 1 番鸭胚垂直传播病毒(RT-)PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了番鸭胚垂直传播病毒（RT-）PCR检测技术的术语与定义、仪器与设备、试剂和材料、操作步骤和结果判定。本标准适用于番鸭胚垂直传播病毒的（RT-）PCR检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 禽流感防治技术规范（农医发200712号）3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 番鸭胚垂直传播病毒 Vertical transmission virus in Muscovy duck embryo 可以通过番鸭胚垂直传播的病毒统称，包括鸭甲肝病毒 1 型（Duck Hepatitis Virus type 1,DHAV-1）、鸭甲肝病毒 3 型（Duck Hepatitis Virus type 3,DHAV-3）、番鸭细小病毒（Muscovy Duck Parvovirus,MDPV）、鹅细小病毒（Goose Parvovirus,GPV）、番鸭呼肠孤病毒（Muscovy Duck Reovirus,MDRV）、新型番鸭呼肠孤病毒（Novel Muscovy Duck Reovirus,N-MDRV）、H9 亚型禽流感病毒（H9 subtype of Avian Influenza Virus,H9-AIV）。4 仪器与设备 4.1 PCR 扩增仪。4.2 台式低温高速离心机，温控范围：-425。4.3 电泳仪，电压范围：60120 V。4.4 紫外凝胶成像系统。4.5 组织匀浆器。4.6 微波炉。4.7 水浴锅，温控范围：37100。4.8 微量移液器，可调控量程：0.510 L，10100 L，1001000 L。DB34/T 36532020 2 5 试剂和材料 5.1 10的十二烷基磺酸钠。5.2 RNA 提取试剂Trizol。5.3 三氯甲烷。5.4 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水，实验用水应符合 GB/T 6682 的要求。5.5 磷酸盐缓冲液（PBS），见附录 A.1。5.6 蛋白酶K（10 mg/mL），见附录A.2。5.7 异丙醇。5.8 Tris饱和酚。5.9 酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1）。5.10 75乙醇，见附录 A.3。5.11 乙酸钠（3 mol/L，pH 5.4）。5.12 无水乙醇。5.13 核糖核酸酶（20 mg/mL）。5.14 TAE 电泳缓冲液，见附录 A.4。5.15 10加样缓冲液，见附录 A.5。5.16 对照样品：DHAV-1、DHAV-3、MDPV、GPV、MDRV、N-MDRV 和H9-AIV 阳性对照样品均为以上病毒接种的番鸭胚尿囊液；阴性对照样品：未接种的正常番鸭胚尿囊液；以灭菌 PBS为空白对照。5.17 引物设计与合成：分别根据 DHAV 基因组 3端核苷酸序列、GPV和 MDPV 基因组 NS 基因、MDRV 的C 蛋白基因片段保守区设计特异性引物；H9 亚型 AIV HA 基因特异引物均参照农业部颁布的禽流感防治技术规范（农医发200712号）进行合成，引物序列及预期片段大小说明见表 1：表1 病毒名称 引物 预期片段大小说明 DHAV F:5-AGGCCCAGAAGCATTCAAACA-3 R:5-TGGGTGTTTTACGTGTACTC-3 DHAV-1为 258 bp，DHAV-3为 321 bp GPV 和 MDPV F:5-CAATGGGCTTTTACCAATATGC-3 R:5-ATTTTTCCCTCCTCCCACCA-3 641 bp MDRV F:5-GAATCGTGGTCTAGCGAC-3 R:5-CTCGCATCTGCTGATCATAATTACC-3 580 bp N-MDRV F:5-ACCTCAGGATATCGCTGAAACT-3 R:5-CTCCATCCCTGCAGCACATGTAAAG-3 600 bp H9-AIV F:5-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3 R:5-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-3 732 bp 6 操作步骤 6.1 操作方法 以下所有实验室操作均按照 GB 19489 和 GB/T 27401 中给出的方法执行。6.2 样品采集与处理 DB34/T 36532020 3 6.2.1 采集对象 选择孵化过程中的死亡种番鸭胚、晚啄壳种番鸭胚和孵出的 1 日龄弱雏作为采集对象。6.2.2 样品采集 6.2.2.1 对未形成胚体或胚体较小的种番鸭胚，无菌采其尿囊液。6.2.2.2 对孵化期间死亡的种番鸭胚，无菌采集其胚体。6.2.2.3 对无尿囊液的大日龄种番鸭胚、晚啄壳种番鸭胚等，则无菌采集胚体的肝脏和脾脏组织。6.2.2.4 对刚出壳的 1 日龄弱雏，按每批次不少于 10 羽的要求随机无菌采集其肝脏和脾脏组织。6.2.3 样品的处理 采集的尿囊液经 8000 g 离心 10 min，取上清分装后，于-20冻存备用；采集的组织经剪碎处理后，与 PBS 按照体积比 1:3 的比例制成组织匀浆液，反复冻融 3 次，8000 g 离心 10 min，取上清分装后，于-20冻存备用。6.3 PCR 检测 6.3.1 核酸 DNA提取方法 6.3.1.1 取420 L 组织匀浆液和 30 L 核糖核酸酶加入 1.5 mL 灭菌离心管混匀后，室温作用 20 min。6.3.1.2 取40 L 10的十二烷基硫酸钠溶液和 10 L蛋白酶K 溶液，56水浴2 h。6.3.1.3 加入等量的 Tris饱和酚，颠倒充分混匀，12000 g 离心5 min，小心吸取上层水相于另一1.5 mL 灭菌离心管中。6.3.1.4 加入等量的酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1），颠倒充分混匀，12000 g 离心 5 min，小心吸取上层水相于另一 1.5 mL 灭菌离心管中。6.3.1.5 加入 1/10 体积的乙酸钠、2 倍体积冰冻预冷的无水乙醇混匀后，-20放置 2 h。12000 g 离心 15 min，弃去乙醇。加入 600 L 75冰冻预冷的乙醇清洗 2 次，倒置于吸水纸上 5 min，室温晾干。加入 20 L灭菌双蒸水溶解沉淀，-20放置备用。6.3.2 核酸 DNA样品 PCR扩增方法 6.3.2.1 PCR 反应体系为 50 L，每个反应管的反应液配置为：依次加入 5 L 10PCR 缓冲液，上下游引物（引物浓度均为 20 M）各1 L，4 L dNTP Mixture（各 2.5 mM），1 L 提取的核酸 DNA，37.5 L 灭菌双蒸水，0.5 L Taq 聚合酶。2000 g离心 15 s，使反应混合液都沉降到 PCR 管底。6.3.2.2 将上述反应混合液按照以下步骤进行 PCR 扩增，94预变性 5 min；循环参数为 94变性50 s，54退火 30 s，72延伸 35 s，循环 35 次；第三步 72再延伸 7 min 结束。6.3.3 核酸 DNA样品 RFLP分析（EcoR酶切）方法 对其中的 MDPV 和 GPV 阳性样品，分别取 20 L PCR 产物，3 L 10H 缓冲液，5 L 灭菌双蒸水，2 L EcoR酶，37水浴 1 h。6.4 RT-PCR检测 6.4.1 核酸 RNA提取方法 6.4.1.1 取250 L 组织匀浆液加入 1.5 mL 灭菌离心管后，加入 750 mL RNA 提取试剂 Trizol，充分混匀15 s，再加入200 L 预冷的三氯甲烷，充分倒置混匀，室温静置 10 min。DB34/T 36532020 4 6.4.1.2 4条件下，12000 g 离心 15 min。取经焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水处理的 1.5 mL灭菌离心管，小心吸取离心上清液 600 L，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀。6.4.1.3 4条件下，12000 g 离心 15 min。轻轻倾倒上清液，加入 800 L 75%乙醇清洗 2 次，倒置于吸水纸上 5 min，室温晾干。6.4.1.4 加20 L 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水，轻轻混匀溶解离心管壁上核酸 RNA，2000 g 离心30 min，提取的RNA 应在2 h内进行 RT-PCR 扩增或保存于-80。6.4.2 核酸 RNA样品 RT-PCR扩增方法 6.4.2.1 PCR 反应体系为 50 L，每个反应管的反应液配置为：依次加入 28 L 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理水，5 L 反转录酶缓冲液，5 L Taq 聚合酶缓冲液，1 L dNTP，1 L Taq 聚合酶，1 L 反转录酶，1 L RNA 酶抑制剂，上下游引物（引物浓度均为 20 M）各 1 L，6 L 提取的核酸 RNA。2000 g 离心 15 s，使反应混合液都沉降到 PCR 管底。6.4.2.2 将上述反应混合液按照以下步骤进行一步法 RT-PCR 扩增，第一步是反转录，42反转录 30 min；第二步 PCR 循环，94预变性 5 min；循环参数为 94变性 50 s，54退火 30 s，72延伸 35 s，循环 35 次；第三步 72再延伸 7 min 结束。6.5 电泳 将 PCR 扩增产物 5 L 与 0.5 L 10加样缓冲液混合，然后加入到 1.0琼脂糖凝胶板的加样孔中，加上 DL2000 DNA Marker 5 L，以 5 V/cm 的电压进行电泳，30 min 后在紫外凝胶成像系统观察结果。7 结果判定 7.1 鸭甲肝病毒 7.1.1 当 DHAV-1 阳性对照出现约 258 bp，DHAV-3 阳性对照出现约 321 bp 特异性条带、阴性对照无扩增条带，空白对照无扩增条带，则此次实验结果成立且有效。7.1.2 当待检样品出现约 258 bp 条带，判为 DHAV-1 感染阳性；当待检样品出现约 321 bp条带，判为DHAV-3 感染阳性（见附录 B.1）。7.2 番鸭细小病毒和鹅细小病毒 7.2.1 当 MDPV 和 GPV 阳性对照出现约 641 bp特异性条带、阴性对照无扩增条带，空白对照无扩增条带，则此次实验结果成立且有效（见附录 B.2 A）。7.2.2 将 PCR 产物经 EcoR I 酶切后，可见 MDPV 的PCR 扩增产物经 EcoR I 酶切后电泳条带为两条，其大小分别约为 460 bp和180 bp。GPV的 PCR 扩增产物经 EcoR I 酶切后电泳条带大小不变，还是约 641 bp（见附录B.2 B）。7.3 番鸭呼肠孤病毒 7.3.1 当 MDRV 阳性对照出现约 580 bp 特异性条带、阴性对照无扩增条带（见附录 B.3 电泳图 3 号泳道），空白对照无扩增条带，则此次实验结果成立且有效。7.3.2 当待检样品出现约 580 bp 条带，判为 MDRV 感染阳性（见附录 B.3）。7.4 新型番鸭呼肠孤病毒 DB34/T 36532020 5 7.4.1 当 N-MDRV 阳性对照出现约 600 bp 特异性条带、阴性对照无扩增条带，空白对照无扩增条带，则此次实验结果成立且有效。7.4.2 当待检样品出现约 600 bp 条带，判为 MDRV 感染阳性（见附录 B.4）。7.5 H9亚型禽流感病毒 7.5.1 当 H9-AIV 阳性对照出现约 732 bp 特异性条带、阴性对照无扩增条带，空白对照无扩增条带，则此次实验结果成立且有效。7.5.2 当待检样品出现约 732 bp 条带，判为 H9-AIV 感染阳性（见附录 B.5）。DB34/T 36532020 6 A A 附 录 A（规范性附录）相关试剂的配制 以下试剂配制所用的灭菌双蒸水水质应符合 GB/T 6682 的要求。A.1 0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS）A.1.1 成分 NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO412H2O 2.9 g KH2PO4 0.2 g A.1.2 制法 将上述试剂溶于 800 mL 灭菌双蒸水中，定容至 1000 mL，1.034105 Pa 高压灭菌 30 min，4保存备用。A.2 蛋白酶K（10 mg/mL）制法 将蛋白酶 K（20 mg/mL）和灭菌水按照体积比 1:1 配置，使用前现用现配。A.3 75乙醇制法 取无水乙醇 750 mL 加入灭菌双蒸水 250 mL，定容至 1 000 mL，-20保存备用。A.4 1TAE电泳缓冲液 A.4.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0）制法 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61 g 氢氧化钠 调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 至 100 mL A.4.2 50TAE电泳缓冲液制法 羟基甲基氨基甲烷（Tris）242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）100 mL 灭菌双蒸水 至 1 000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释 50 倍使用。DB34/T 36532020 7 A.4.3 1TAE电泳缓冲液制法 50TAE 电泳缓冲液 20 mL 灭菌双蒸水 至 1 000 mL A.5 10加样缓冲液制法 聚蔗糖 25 g 溴酚蓝 0.1 g 二甲苯青 0.1 g 灭菌双蒸水 至 100 mL DB34/T 36532020 8 B B 附 录 B（规范性附录）番鸭胚垂直传播病毒（RT-）PCR检测结果判定 B.1 DHAV RT-PCR 检测结果电泳图 见图B.1。图中：M，DL2000 Marker；1，DHAV-1阳性对照样品；2，DHAV-3阳性对照样品；3，DHAV-1阳性样品；4，DHAV-3阳性样品；5，阴性对照样品；6，空白对照样品。图B.1 DHAV RT-PCR检测结果电泳图 DB34/T 36532020 9 B.2 MDPV 和 GPV PCR 检测结果电泳图 见图B.2。A PCR产物酶切前电泳图 B PCR产物酶切后电泳图 图中：M，DL2000 Marker；1，MDPV阳性对照样品；2，GPV阳性对照样品；3，MDPV阳性样品；4，GPV阳性样品；5，阴性对照样品；6，空白对照样品。图B.2 MDPV和 GPV PCR检测结果电泳图 DB34/T 36532020 10 B.3 MDRV RT-PCR检测结果电泳图 见图B.3。图中：M，DL2000 Marker；1，MDRV阳性对照样品；2，MDRV阳性样品；3，阴性对照样品；4，空白对照样品。图B.3 MDRV RT-PCR检测结果电泳图 DB34/T 36532020 11 B.4 N-MDRV RT-PCR检测结果电泳图 见图B.4。图中：M，DL2000 Marker；1，N-MDRV阳性对照样品；2，N-MDRV阳性样品；3，阴性对照样品；4，空白对照样品。图B.4 N-MDRV RT-PCR检测结果电泳图 DB34/T 36532020 12 B.5 H9-AIV RT-PCR检测结果电泳图 见图B.5。图中：M，DL2000 Marker；1，H9-AIV阳性对照样品；2，H9-AIV阳性样品；3，阴性对照样品；4，空白对照样品。图B.5 H9-AIV RT-PCR检测结果电泳图 _