动物垫料中霉菌检测DB15／T 1851—2020.pdf

ICS 07.100.99 B 41 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1851 2020 动物垫料 中霉菌检 测 Detection for mold count in animal bedding 2020-02-25 发布 2020-03-25 实施 内 蒙 古 自 治 区 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB15/T 1851 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出 的规 则起 草。本标准 由中 华人 民共 和国 呼和浩 特海 关提 出并 归口。本标准 起草 单位：中 华人 民共和 国呼 和浩 特海 关、内蒙古 自治 区农 牧业 科学 院、内 蒙古 农业 大 学。本标准 主要 起草 人：赵治 国、王 海艳、于 志超、陈 林军、延涵、崔 强、敖威 华、盛 万里、杨 帆、李军燕、罗晓 平、姚利 宏。DB15/T 1851 2020 1 动 物垫料 中霉菌检 测 1 范围 本标准 规定 了动 物垫 料中 霉菌平 板计数 检 测法。本标准 适用 于动 物垫 料中 霉菌的 定量 检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB/T 8170 数 值修 约规 则 与极限 数值 的表 示和 判定 SN/T 1538.1 培养 基制 备 指南 第1 部分：实 验室 培 养基制 备质 量保 证通 则 SN/T 1538.2 培养 基制 备 指南 第2 部分：培 养基 性 能测试 实用 指南 3 术语和 定义 下列术语 和定义 适用于 本文 件。3.1 动 物垫料 animal bedding 用于吸收 动物排 泄物，使 动 物保持舒 适生活 环境的 铺垫 物。包括动 物笼内 非直接 与 动物机体 接触的 铺垫物。3.2 菌 落形成 单位 colony forming unit（CFU）在琼脂 平板 上经 过一 定温 度和时 间培 养后 形成 的每 一个菌 落，是计 算细 菌或 霉菌数 目的 单位。4 设备和 材料 4.1 恒温 培养 箱：28 1。4.2 均质 器。4.3 天平：感 量 0.1 g，0.0001 g。4.4 漩涡 混合 器。4.5 恒温 水浴 箱：46 1。4.6 高压 蒸汽 灭菌 器。4.7 无菌 试管：18 mm 180 mm。DB15/T 1851 2020 2 4.8 无菌 均质 杯或 无菌 滤 膜均质 袋。4.9 无菌 平皿：15 mm 90 mm。4.10 无菌 锥形 瓶：500 mL。4.11 无菌 量筒。4.12 无菌 规格 板：5 cm 5 cm。4.13 无菌 吸管：1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)。4.14 无菌 棉签。4.15 无菌 镊子。4.16 无菌 剪刀。4.17 无菌 勺。5 培养基 和试 剂 5.1 实验 用水：符 合GB/T 6682 的 要求。5.2 生理 盐水：见 附录A.2。5.3 磷酸 盐缓 冲液：见 附 录 A.3。5.4 孟加 拉红 琼脂：见 附 录 A.4。5.5 马铃 薯葡 萄糖 琼脂：见附 录 A.5。6 操作步 骤 6.1 采样 6.1.1 采样原 则 样品采集 应遵循 随机性、代 表性的原 则。采 样过程 遵循 无菌操作 程序，防止一 切可 能的外来 污染。6.1.2 颗粒状 或粉 末状 样品 对送检样品包装内不同部 位 样品进行随机多点取样至 少250 g，充 分 混 匀 后 称取25 g 颗 粒 状 或 粉末 状 垫料样品，加入225 mL 无 菌 稀释 液（磷 酸 盐 缓 冲 液 或生 理盐 水），充 分 振 摇 或 均质1 min 2 min，制成1：10的样品匀 液。6.1.3 平面样 品 无菌操作 将灭菌 规格板（5 cm 5 cm）放在平面垫料表 面，用浸有 无菌稀 释液（磷酸 缓冲液或 生理盐 水）的棉拭子，在规格 板内来 回 均匀涂抹 整个方 格3 次，并 随之转动 棉拭子，然后用 灭 菌剪刀剪 去棉拭 子与手 接触的部分，将棉 拭子头 置入 装有25 mL 无菌稀释液的 无菌 锥形瓶中，根据 样品面 积大 小重复采 样1 4 个规格板面积，采样量 见表1，相应 地将棉拭 子头置 入25 mL 100 mL 的无菌稀释液中，充分 振摇制成 样品原 液（1 mL原液对应 的样品 面积为1 cm2）。取1 mL 样品原液注 入含 有9 mL 无菌稀释液的 试管中，制成1：10的样品匀 液。DB15/T 1851 2020 3 表1 不同面 积平 面类 垫料 样品 采样量 样品面积 m2 采样量 cm2 规格板数 小于0.25（含）25 1 0.25 0.5（含）50 2 0.5 0.75（含）75 3 大于0.75 100 4 6.2 稀释 6.2.1 取1 mL 1:10 样 品匀 液注 入 含有 9 mL 无菌 稀释 液的 试 管中，另换 一 支1 mL 无 菌 吸管反 复吹 吸，或在旋 涡混 合器 上混 匀，此液 为 1:100 的 样品 匀液。6.2.2 按5.2.1 操 作，制备10 倍 递增系 列稀 释样 品匀 液。每 递增稀 释一 次，换用1 支1 mL 无 菌吸 管。6.2.3 根据对 垫料 样品 污染 状况 的估计，选择 2 3 个适 宜 稀释度 的样 品匀 液（液体 样 品可包 括原 液），在进 行10 倍递 增稀 释的 同时，每个 稀释 度分 别吸 取 1 mL 样 品匀 液于2 个 无 菌平皿 内。同时 分别 取 1 mL无菌稀 释液 加 入2 个无 菌 平皿作 空白 对照。6.2.4 及时 将20 mL 25 mL 冷却 至46 1 的马 铃薯 葡萄糖 琼脂 或孟 加拉 红琼 脂(可 置于46 1 恒 温水 浴箱 中保 温)倾 注平皿，并 转动 平皿 使其 混合均 匀。置水 平台 面待 培养基 完全 凝固。6.3 培养 将马铃 薯葡 萄糖 琼脂 平板 或孟加 拉红 琼脂 平板 正置 于 28 1 专用 培养 箱中培 养，从第 3 天开始观察 霉菌 菌落 数，并做 相应标 记和 记录，直 到 第5 d 的 培养 结束，最 终霉 菌 菌落数 以 第5 d 计数 结果为准。6.4 菌落计 数 用 肉 眼 观察，必要 时 可用放 大 镜 或低 倍 镜，记 录稀释 倍 数 和相 应 的霉 菌 菌落数，以 菌落 形 成单 位（colony-forming units，CFU）表 示。选取 菌落 数 在 10 CFU 150 CFU 的平 板计数 霉菌。霉 菌蔓 延生长覆盖 整个 平板 的可 记录 为菌落 蔓延。7 结果与 报告 7.1 结果 7.1.1 若只有 一个 稀释 度的 两个 平板霉 菌菌 落数 在10 CFU 150 CFU 时，计算 同一 稀释度 的两 个平 板菌落数 的平 均值，再 将平 均值乘 以相 应稀 释倍 数。7.1.2 若有两 个稀 释度 平板 上菌 落数均 在 10 CFU 150 CFU 时，按以 下公 式进 行计 算：d n nCN)1.0(2 1（1）式中：N 样品 中霉 菌数；C 平 板（含适 宜范 围 菌落数 的平 板）菌落 数之 和；DB15/T 1851 2020 4 n1 第一 稀释 度（低稀 释 倍数）平板 个数；n2 第二 稀释 度（高稀 释 倍数）平板 个数；d 稀释 因子（第 一稀 释 度）。7.1.3 若所有 平板 上菌 落数 均大 于150 CFU，则 对稀 释度 最高的 平板 进行 计数，其 它平板 可记 录为 多不可计，结 果按 平均 菌落 数乘以 最高 稀释 倍数 计算。7.1.4 若所有 平板 上菌 落数 均小 于 10 CFU，则 应按 稀释 度 最低的 平均 菌落 数乘 以稀 释倍数 计算。7.1.5 若所有 稀释 度（包括 液体 样品原 液）平板 均无 菌落 生长，则以 小 于 1 乘以 最 低稀释 倍数 计算。7.1.6 若所有 稀释 度的 平板 菌落 数均不 在 10 CFU 150 CFU 之间，其 中一 部分 小于10 CFU 或大 于150 CFU 时，则 以最 接近10 CFU 或 150 CFU 的 平均 菌落 数乘以 稀释 倍数 计算，同 时应选 取稀 释倍 数较 少的平均菌 落数 进行 计算。7.2 报告 7.2.1 霉菌菌 落数 按“四舍 五入”原则 修约。霉 菌菌 落数 在 10 CFU 以内 时，采用 一 位有效 数字报 告；霉菌菌 落数 在 10 CFU 100 CFU 之间 时，采用 两位 有效数 字报 告。7.2.2 霉菌菌 落数 大于 或等于 100 CFU 时，第 3 位数 字采 用“四舍 五入”原 则修 约后，取前 2 位数 字，后面 用 0 代 替位 数来 表示 结果；也可 用 10 的 指数 形 式来表 示，此时 也按“四 舍五入”原 则修 约，采用两位有 效数 字。具体 修约 规则按 照 GB/T 8170 执行。7.2.3 若空白 对照 平板 上有 霉菌 菌落出 现，则此 次检 测结 果无效。7.2.4 以CFU/g 或CFU/cm2为 单位 报告霉 菌数。DB15/T 1851 2020 5 A A 附 录 A（规范 性附 录）培养基 和试 剂 A.1 培养基 制备 及质 量保 证 按照SN/T 1538.1 和SN/T 1538.2 执 行，并对 制备 好的 培养基 进行 性能 测试，如 使用等 效的 脱水 合成培养基，使 用前 对其 进行 验收并 按其 说明 书使 用。A.2 生理盐 水 A.2.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 mL A.2.2 制法 氯化 钠 加入1000 mL 蒸馏 水 中，搅 拌至 完全 溶解，分 装后，121 高 压灭 菌15 min，备用。A.3 磷酸盐 缓冲 液 A.3.1 成分 磷酸二 氢钾 34.0 g 蒸馏水 1000 mL A.3.2 制法 贮存液：称 取34.0 g 的磷 酸二氢 钾溶 于500 mL 蒸馏 水中，用大 约175 mL 的1 mol/L 氢 氧化 钠溶 液调节pH至 7.2 0.1，用 蒸馏 水稀释 至1000 mL 后 贮存 于 冰箱。稀释液：取贮 存液1.25 mL，用 蒸馏 水稀 释至1000 mL，分 装于 适宜 容器 中，121 高压 灭菌15 min。A.4 孟加拉 红培 养基 A.4.1 成分 蛋白胨 5.0 g 葡萄糖 10.0 g 磷酸二 氢钾 1.0 g 硫酸镁（无 水）0.5 g 琼脂 20 g 孟加拉 红 0.033 g 氯霉素 0.1 g DB15/T 1851 2020 6 蒸馏 水 1000 mL A.4.2 制法 上述各 成分 加入 蒸馏 水中，加热 溶解，补 足蒸 馏水 至1000 mL，分 装后，121 高压 灭菌15 min，避光保 存备 用。A.5 马铃薯 葡萄 糖琼 脂 A.5.1 成分 马铃薯 浸粉 5 g 葡萄糖 20 g 琼脂 20 g 氯霉素 0.1 g 蒸馏水 1000 mL A.5.2 制法 准确称 取以 上成 分，加1000 mL 蒸 馏水，加 热煮 沸至 完全溶 解，121 高 压灭 菌15 min，备用。_