鲜、冻畜禽肉中磺胺类、喹诺酮类和四环素类兽药残留量的测定 液相色谱-串联质谱法DB12／T 987—2020.pdf

ICS 65.020.30 B 41 DB12 天津市 地 方 标 准 DB12/T 987 2020 鲜、冻畜 禽肉中磺 胺类、喹 诺酮类和 四环素类兽药残 留量的测 定 液相色 谱-串联质 谱法 Determination of residues of sulfonamides,quinolones and tetracyclines in fresh and frozen meat of livestock and poultry by liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2020-10-14 发布 2020-11-15 实施 天 津 市 市 场 监 督 管 理 委 员 会 发布 DB12/T 987 2020 I 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、摩天众创（天津）检测服务有限公司。本标准主要起草人：李娜、林宏芳、邵辉、李辉、刘磊、张玉婷、郭永泽、绳慧珊、卢娜、冯兆欣、郝玉杰、潘喆。DB12/T 987 2020 1 鲜、冻畜 禽肉中磺 胺类、喹诺酮类 和四环 素类兽药 残留量 的测定 液相 色谱-串联 质谱法 1 范围 本标准规定了鲜、冻畜禽肉中磺胺类、喹诺酮类和四环素类兽药残留量的测定-液相色谱-串联质谱法的方法提要、试剂和材料、仪器和设备、试样制备与保存、测定步骤、灵敏度、准确度和精密度。本标准适用于鲜、冻畜禽肉中磺胺类、喹诺酮类和四环素类共28种兽药残留的测定。2 规范性 引用 文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提 要 试样经酸化乙腈提取，提取液浓缩、甲醇定容后，用液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）测定，基质外标法定量。4 试剂和 材料 4.1 基本要 求 除另有说明外，所用试剂均为分析纯。所用水为GB/T 6682规定的一级水。4.2 试剂 4.2.1 乙腈：色谱纯。4.2.2 甲醇：色谱纯。4.2.3 甲酸：色谱纯。4.2.4 乙酸：色谱纯。4.2.5 正己烷。4.2.6 无水硫酸钠。4.2.7 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA 2H2O）。4.2.8 柠檬酸（C6H8O7 H2O）。4.2.9 磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O）4.2.10 氢氧化钠（NaOH）。4.3 溶液配 制 DB12/T 987 2020 2 4.3.1 氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取4.0 g氢氧化钠，用水溶解并定容至 100 mL。4.3.2 氢氧化钠溶液（0.03 mol/L）：称取0.12 g氢氧化钠，用水溶解并定容至 100 mL。4.3.3 Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液（0.1 mol/L）：称取 12.9 g柠檬酸，10.9 g磷酸氢二钠，37.2 g 乙二胺四乙酸二钠，加900 mL水溶解，用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH值至4.0，加水定容至1000 mL。4.3.4 0.1%甲酸水：移取 0.1 mL甲酸加入100 mL 水中，混匀。4.3.5 0.1%甲酸甲醇：移取 0.1 mL甲酸加入100 mL甲醇中，混匀。4.3.6 甲醇-0.1%甲酸（10:90，V:V）：移取10 mL 甲醇加入90 mL 0.1%甲酸水溶液中，混匀。4.4 标准品 磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、麻保沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹、土霉素、金霉素、强力霉素标准品：纯度98.0%；环丙沙星纯度95.0%，(达氟)单诺沙星纯度94.0%，沙拉沙星纯度95.0%，四环素纯度96.5%。4.5 标准溶 液配制 4.5.1 标准储备溶液（1000 mg/L）：准确称取10 mg各兽药标准品，根据标准品的溶解性不同，磺胺类、四环素类兽药用乙腈溶解并定容至10 mL，喹诺酮类兽药先用 2 mL氢氧化钠溶液溶解，甲醇定容至10 mL，于-18避光保存，有效期 1年。4.5.2 标准工作溶液：分别吸取28种兽药标准储备液 0.25 mL于25 mL容量瓶，用乙腈稀释并定容，配制成浓度为10 mg/L的混合标准工作液，于 4 避光保存，有效期 1个月。4.6 材料 4.6.1 十八烷基硅烷键合硅胶（C18）：4060 m。4.6.2 氨基硅烷化硅胶（NH2）：4060 m。4.6.3 微孔滤膜（有机相）：0.22 m。5 仪器和 设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。5.2 分析天平：感量0.0001 g和0.01 g。5.3 台式高速离心机：转速不低于 4000 r/min。5.4 匀浆机。5.5 涡旋混合器。5.6 氮吹仪。5.7 纯水仪。6 试样制 备与 保存 6.1 试样制 备 鲜、冻畜禽肉类样品剔去毛、淤血、骨等，取缩分后样品，用匀浆机捣碎成肉糜状，混匀，装入清洁容器内，密封并标识。用冷冻畜禽肉类样品在室温下自然解冻至稍微变软，且冻水未流出待制备。DB12/T 987 2020 3 6.2 试样保 存 试样应在-18 条件下保存。7 测定步 骤 7.1 样品前 处理 准确称取试样2.00 g（精确至0.02 g）于50 mL聚丙烯塑料离心管中，加入2 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液，3 mL乙腈，涡旋2 min，4000 r/min离心5 min，收集上清液于另一50 mL离心管中，残渣加5 mL乙腈，涡旋2 min，4000 r/min离心5 min，合并上清液于上述50 mL离心管中。于上清液中依次加入200 L乙酸，1 g氯化钠，涡旋1 min，4000 r/min离心5 min，取上层乙腈相2 mL于10 mL聚丙烯塑料离心管中，加入C18和NH2吸附剂各100 mg，涡旋1 min，4000 r/min离心5 min，取上清液，氮气吹干。残渣用1 mL 甲醇-0.1%甲酸水（10:90，V:V）定容，过0.22 m有机滤膜。7.2 测定 7.2.1 液相色谱条件如下：色谱柱：Acquity BEH RP18柱(2.1100 mm，1.7 m)；流动相：A相：0.1%甲酸甲醇；B 相：0.1%甲酸水；梯度洗脱条件见表 1。进样量：10 L；柱温：30。表1 梯度洗 脱条 件 时间(min)流速(mL/min)VA(%)VB(%)曲线a 0 0.2 5 95 Initial 3 0.2 20 80 6 7 0.2 40 60 6 10 0.2 40 60 6 11 0.2 90 10 6 12 0.2 90 10 6 14 0.2 5 95 1 a 表示线性变化，1 表示立即变化。7.2.2 质谱条件如下：电离源：电喷雾正离子(ESI+)；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：120；脱溶剂气温度：400；脱溶剂气流量：600 L/h；锥孔反吹气流量：60 L/h；检测方式：多反应监测（MRM）；质谱采集参数附录A。7.3 定性 DB12/T 987 2020 4 液相色谱-串联质谱法对样品定性确证须满足以下要求：待测样品的保留时间在外标标准样品的保留时间的2.5%之内；定性离子的信噪比大于 3（S/N3）；与外标标准品相比，样品的两个特征离子相对丰度在表 2规定的许可范围内。28种兽药的多反应监测（MRM）色谱图参见附录B。表2 定性确 证时 相对 离子 丰度 的最大 允许 偏差 相对离子丰度比（%）允许的最大偏差（%）50 20 2050 25 1020 30 10 50 7.4 定量 采用外标法定量。用色谱数据处理软件或按公式（1）计算试样中的目标物含量（g/kg）：mVVVAAss123.(1)式中：试样中目标物的含量，单位为微克每千克（g/kg）；s 目标物标准工作溶液的浓度，单位为微克每升（g/L）；A 试样测定液中目标物定量离子的峰面积；As 标准工作溶液中目标物定量离子的峰面积；V1 提取溶液中乙腈的总体积（mL）；V2 吸取用来净化的提取溶液的体积（mL）V3 最终定容体积（mL）；V 试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；m 试样溶液所代表试样的量，单位为克（g）；注：计算结果保留两位有效数字，当结果大于1 g/kg时保留三位有效数字。8 灵敏度 28种兽药的检测限在0.5 g/kg3.0 g/kg之间。磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、麻保沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、单诺沙星、环丙沙星、恩诺沙星、二氟沙星、沙拉沙星、噁喹酸、氟甲喹的定量限为5.0 g/kg，四环素、土霉素、金霉素和强力霉素的定量限均为10.0 g/kg。9 准确度 和精 密度 9.1 准确度 DB12/T 987 2020 5 9.1.1 鲜、冻畜禽肉中磺胺类和喹诺酮类兽药在 5 g/kg50 g/kg 添加水平，回收率在70%110%之间；9.1.2 鲜、冻畜禽肉中四环素类兽药在10 g/kg50 g/kg 添加水平，回收率在 70%110%之间。9.2 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。DB12/T 987 2020 6 A A 附 录 A（资料 性附 录）28 种 兽药 检测 表A.1 28 种 兽药 中英 文名 称、保 留时间、质 谱检 测条 件和 定量限 名称 保留时间(min)定性离子对(m/z)定量离子对(m/z)锥孔电压(V)碰撞能量(V)检测限(g/kg)定量限(g/kg)磺胺醋酰 Sulfacetamide 4.15 215/155.8;215/107.7 215/155.8 18 12;23 1.2 5.0 磺胺嘧啶 Sulfadiazine 4.52 251/155.8;251/107.7 251/155.8 25 18;28 1.3 5.0 磺胺吡啶 Sulfapyridine 4.87 250.2/155.8;250.2/184 250.2/155.8 25 15;16 1.0 5.0 磺胺噻唑 sulfathiazole 4.99 256.2/107.8;256.2/155.8 256.2/107.8 20 14;21 1.5 5.0 磺胺甲基嘧啶 Sulfamerazine 5.38 265/155.8;265/171.8 265/171.8 25 20;16 0.5 5.0 麻保沙星 Marbofloxacin 5.38 363.1/320.1;363.1/345 363.1/320.1 30 20;23 1.2 5.0 四环素 Tetracycline 5.94 445/428;445/410 445/410 25 19;25 2.8 10 氧氟沙星 Ofloxacin 6.03 362/318.2;362/261.1 362/261.1 30 24;31 0.5 5.0 磺胺二甲基嘧啶 Sulfamethazine 6.17 279/186;279/124 279/186 30 16;20 0.5 5.0 土霉素 Oxytetracycline 6.15 461/443;461/426 461/426 25 15;25 3.0 10 诺氟沙星 Norfloxacin 6.63 320.1/276.1;320.1/302.1 320.1/302.1 30 20;24 1.0 5.0 单诺（达氟）沙星 Danofloxacin 6.82 358.1/340.1;358.1/81.6 358.1/340.1 25 28;45 1.5 5.0 环丙沙星 Ciprofloxacin 6.77 332.1/314.1;332.1/288.1 332.1/314.1 30 25;20 1.0 5.0 恩诺沙星 Enrofloxacin 6.82 360.2/316;360.2/245 360.2/316 30 25;33 1.0 5.0 磺胺甲氧哒嗪 Sulfamethoxypyridazine 6.80 281/155.8;281/107.7 281/155.8 30 20;30 0.8 5.0 DB12/T 987 2020 7 磺胺甲噻二唑 Sulfamethizole 6.80 271.2/107.8;271.2/155.8 271.2/155.8 22 22;13 0.8 5.0 二氟沙星 Difloxacin 7.37 400/382;400/356 400/382 35 25;24 0.5 5.0 沙拉沙星 Sarafloxacin 7.87 386/368;386/299 386/368 35 24;35 0.5 5.0 磺胺氯哒嗪 Sulfachloropyridazine 8.13 285/155.8;285/107.7 285/155.8 24 20;30 1.2 5.0 磺胺甲噁唑 Sulfamethoxazole 8.24 254/155.8;254/107.7 254/155.8 25 20;25 0.8 5.0 金霉素 Chlortetracycline 8.77 479/462;479/444 479/444 35 20;25 3.0 10 磺胺间甲氧嘧啶 Sulfamonomethoxine 8.70 281/155.8;281/107.7 281/155.8 30 18;25 1.3 5.0 磺胺异恶唑 sulfisoxazole 9.16 268.3/107.8;268.3/155.8 268.3/155.8 22 26;13 0.8 5.0 强力霉素 Doxycycline 11.48 445/428;445/154 445/428 25 20;35 2.5 10 噁喹酸 Oxolinic acid 11.60 262/244;262/159.8 262/244 27 22;43 1.2 5.0 磺胺间二甲氧嘧啶 Sulfadimethoxine 11.78 311/155.8;311/107.7 311/155.8 32 25;35 1.0 5.0 磺胺喹噁啉 Sulfaquinoxaline 11.92 301/155.7;301/107.7 301/155.7 28 15;25 1.0 5.0 氟甲喹 Flumequine 12.01 262/244;262/202 262/244 25 20;37 0.5 5.0 DB12/T 987 2020 8 B B 附 录 B（资料 性附 录）28 种 兽药 的多 反应 监测（MRM）色谱 图 2.0 4.0 6.00 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.00 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-95 215 155.8(SA)2.39e4.1215 107.7(SA)1.49e4.1251 155.8(SD)1.50e4.5251 107.7(SD)1.89e4.5Tim2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-9250.2 184(SPD)4.76e4.8250.2 155.8(SPD)5.50e4.8256.2 155.8(STZ)7.39e4.9256.2 107.8(STZ)2.31e4.9DB12/T 987 2020 9 Tim2.00 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-5 92.00 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-5 92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-9265 171.8(SM1)1.63e5.3265 155.8(SM1)1.09e5.3363.1 345(MAR)6.27e5.3363.1 320.1(MAR)8.14e5.3Tim2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-9445 427(TC)5.40e5.9445 410(TC)1.01e5.95.011.4362 318.2(OFL)4.21e6.0362 261.1(OFL)4.34e6.0Tim2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-9279 186(SM2)1.65e6.1279 124(SM2)4.47e6.1461 443(OTC)7.38e6.1461 426(OTC)1.12e6.15.5DB12/T 987 2020 10 Tim2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-9320.1 302.1(NOR)3.43e6.6320.1 276.1(NOR)1.98e6.6358.1 340.1(DAN)2.63e6.8358.1 81.6(DAN)2.48e6.87.1Tim2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-9332.1 314.1(CIP)2.29e6.7332.1 288.1(CIP)1.03e6.7360.2 316(ENR)3.11e6.8360.2 245(ENR)1.64e6.8Tim2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-9271.2 155.8(SMTZ)2.42e6.8271.2 107.8(SMTZ)5.43e6.8281 155.8(SMP)2.82e6.8281 107.7(SMP)3.44e6.8DB12/T 987 2020 11 Tim2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-9400 382(DIF)3.79e7.3400 356(DIF)3.26e7.3386 368(SAR)2.54e7.8386 299(SAR)1.12e7.8Tim2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-9285 155.8(SCP)2.09e8.1285 107.7(SCP)2.76e8.1254 155.8(SMZ)1.43e8.2254 107.7(SMZ)2.61e8.2Tim2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-9479 462(CTC)3.02e8.7479 444(CTC)3.46e8.7281 155.9(SMM)6.48e8.7281 107.8(SMM)1.67e8.7DB12/T 987 2020 12 Tim2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-182.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-92.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0%-9268.3 155.8(SIZ)2.69e9.1268.3 107.8(SIZ)7.41e9.1445 428(DC)4.08e11.4445 154(DC)2.74e11.4Tim0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0%-90.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0%-90.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0%-90.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0%-9262 244.1(OA)9.82e12.0262 216(OA)6.38e11.6311 155.8(SDM)9.65e11.7311 107.7(SDM)1.30e11.7Tim0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0%-90.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0%-90.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0%-90.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0%-9301 155.7(SQ)2.39e11.9301 107.7(SQ)9.26e11.9262 244(FLU)7.06e12.0262 202(FLU)2.73e12.0DB12/T 987 2020 13 注1：4.15min-磺胺醋酰(SA)4.52min-磺胺嘧啶(SD)注2：4.87min-磺胺吡啶(SPD)4.99min-磺胺噻唑(STZ)注3：5.38min-磺胺甲基嘧啶(SM1)5.38min-麻保沙星(MAR)注4：5.94min-四环素(TC)6.03min-氧氟沙星(OFL)注5：6.15min-土霉素(OTC)6.17min-磺胺二甲基嘧啶(SM2)注6：6.63min-诺氟沙星(NOR)6.82min-单诺（达氟）沙星(DAN)注7：6.77min-环丙沙星(CIP)6.82min-恩诺沙星(ENR)注8：6.80min-磺胺甲噻二唑(SMTZ)6.80min-磺胺甲氧哒嗪(SMP)注9：7.37min-二氟沙星(DIF)7.87min-沙拉沙星(SAR)注10：8.13min-磺胺氯哒嗪(SCP)8.24min-磺胺甲噁唑(SMZ)注11：8.77min-金霉素(CTC)8.70min-磺胺间甲氧嘧啶(SMM)注12：9.16min-磺胺异噁唑(SIZ)11.48min-强力霉素(DC)注13：11.60min-噁喹酸(OA)11.78min-磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)注14：11.92min-磺胺喹噁啉(SQ)12.01min-氟甲喹 图B.1 28 种 兽药 的多 反应 监测（MRM）色 谱图 _