梨枯梢病监测与检测技术规程DB32／T 3788-2020.pdf

ICS 65.020 B 16 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3788 2020 梨枯梢 病 监测与检 测技术规 程 Technical specification for monitoring and detection of Shoot Blight of Asian pear 2020-04-08 发布 2020-05-15 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.12009 给出 的规 则起 草。本标准 由江 苏省 农业 科学 院提出 并归 口。本标准 起草 单位：江 苏省 农业科 学院。本标准 主要 起草 人：刘凤 权、徐 会永、赵 杨扬、赵延 存、孙伟 波。1 梨 枯梢病 监测 与检测 技术 规程 1 范围 本标准 规定 了 梨 枯梢 病监 测与检 测 的 原理、试 剂与 材料、仪器 与用 具、监测 技术、检测 技术、结 果判定和 报告、样 品、菌种 保藏和 无害 化处 理、疫情 处 置等 要求。本标准 适用 于 梨 枯梢 病田间 监测 以及 苗木、砧 木、接穗和 果实 上传 带的 梨枯 梢病 菌 的检 测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少 的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分析 实验 室用 水规格 和试 验方 法 NY/T 2292 亚洲 梨火 疫病 监测技 术规 范 SN/T 1157 进 出境 植物 苗 木检疫 规程 SN/T 1193 基 因分 析检 测 实验室 技术 要求 3 原理 梨枯梢 病，病原 为 亚 洲梨 火疫病菌（Erwinia pyrifoliae Kim et al.），是为害 梨 树的重 要细 菌病 害 之一，属 我国 规定 的检 疫性 有害生 物。可以 根据 田间 症状、菌落 形态 和培 养特 征、致 病性、免疫学反应和分子生 物学 特征 等进行 监 测与 检 测。4 试剂与 材料 检测 中 所需 的所 有 试 剂与 培养基，参 见附 录A。除另有 规定 外，所有 试剂 均为分 析纯 或生 化试 剂。试验 用 水应 符合GB/T 6682 中一级 水的 规格。5 仪器与 用具 超 净工 作台、电 子天 平、磁力搅 拌器、高 压灭 菌锅、培养 箱、水浴 锅、显微 镜、高 速台 式离 心 机、电泳仪、常 规PCR 仪、凝 胶成像 系统、冰 箱、超低 温冰箱、超 纯水 器、恒温 干燥箱、恒 温摇 床、微量 移液器、制冰 机等。6 监测技术 6.1 监测植 物 梨，主 要监 测亚 洲梨。2 6.2 监测区 域 重点监 测 亚 洲梨 集中 种植 区、引 种繁 育基 地、苗木 集散地 等疫 情 发 生高 风险 区。6.3 监测方 法 6.3.1 苗木监测 对从疫 情发 生区 调运 的苗 木或疫 区市 场销 售的 苗木，按照SN/T 1157 要 求进 行 抽样，并对 样品 进 行室内检 测。6.3.2 田间监测 从梨树 开花 期开 始，对 当地 农技 员、果 农等 相关 人 员 进行 访问 调查，并选择有 代表 性的 梨园 进行 踏查。重 点观 察田 间有 无梨 枯梢病 典型 症状（见 附录B），如 发现 可疑 病株 立刻 进行标 记、拍照 并取 样，样品送 实验 室进 行进 一步 检测鉴 定。对 梨 园 中梨 枯 梢疑似 症状 及其 发生 地点、发 生时 间、危 害情 况等 信息进行 记录（见 附录C）。在疫情 发生 区，选 择有 代 表性的 梨园 进行 定点 监测。从梨 树开花 期开 始，每隔7 d 调查 一次。采用5点取样 法，每 点随 机调查5 株，统 计或计 算病 株率和 病梢率，并做 好相 关记录。监测 过程中 病梢 的选 取按照NY/T 2292 中 的规 定执 行。7 检测技 术 7.1 样品处 理 选择表 现典 型症 状并 带有 菌脓的 植物 部位 如花 朵、嫩梢、幼枝、叶 片或 幼果 等，在 无菌 条件 下 切 取病健交 界处 组织 约（3 mm 5 mm）（3 mm 5 mm），表面 消毒 和清 洗后，在装有 适量 无菌 水的 离 心管中轻 轻挤 压，浸泡10 min 30 min 后制 成样 品悬 浮 液。或 者直 接挑 取菌 脓并 用无菌 水清 洗后 制成 样品悬浮液。悬 浮液 可 用 于其 后的形 态观 察、免 疫 学和 分子生 物学 检测 等。7.2 检测方 法 7.2.1 显微镜 检查 对于疑似症状 的植物 组织，切取病健交界处20 mm2，平放在载玻片的水 滴中，加盖玻片后，在 低倍显微 镜 下 观察 有无 喷菌 现象。7.2.2 培养特 征检测 将 样品 悬浮 液在YPDA 培 养基平 板上 划线 或稀 释分 离，28 倒 置培 养24 h 72 h。在YPDA 培 养基 平板上观 察分 离得 到的 细菌 单菌落 的形 状、大小、颜 色、光 泽、隆 起的 形状、粘稠度、透 明度、边缘 特 征以及质 地、水溶 性色 素等 特征，观察 并进 行记 录（参 见附 录B）。7.2.3 形态特 征检测 按照常 规 染 色方 法，在 显 微镜下 观察 细菌 菌体 的形 状、大小 及排 列情 况、有 无 鞭毛及 鞭毛 着生 的位置和数目、是否 产生 荚膜 和芽胞、芽 胞着 生的 部位 和形状、细 胞内 含物 等特 征。7.2.4 致病性 测定 3 取梨幼 果（直径 大约3 cm 5 cm）洗净 晾干，用灭 菌刀片 横切 果实，置于 垫 有湿润 的 灭 菌滤 纸的培养皿中。用 无菌 接种 针蘸 取培养24 h 36 h 的 菌落，针刺接 种于 幼果 果肉 组织，一个 横切 面接 种3 个4个点。接 种后26 保湿 培 养，24 h 后 观察 并记 录接 种 部位有 无坏 死症 状发 生 和 菌脓形成。以无 菌水 为 对照。7.2.5 ELISA 检测 挑取少 量分离 到的 病原菌 配制成108CFU/mL 悬浮液 进行ELISA 检测，检 测程 序 参见 附录D。如 采用商品化ELISA 方 法进 行检 测，按 照说 明书 进行 操作 及结果 判定。7.2.6 PCR 检测 挑取少量分离到的病原菌 配制成108CFU/mL 悬浮液，1 mL 菌悬液提取DNA 后 进行PCR 检测，检测程序见 附录E。如采 用市 售 的试剂 盒，按说 明操 作。检 测过程 中防 污染 措施 按照SN/T 1193 中的 规定 执行。8 结果判 定 和 报告 8.1 结果 判定 8.1.1 症状识 别判 定 田间梨 树发 病症 状符 合附 录B 描述 的梨 枯梢 病典 型症 状，判 断为 梨枯 梢病。8.1.2 常规检测 结 果判 定 镜检有 菌溢 现象；分离 物 形态特 征和 培养 特性 与梨 枯梢病 菌相符（参见 附录B）；致病 性 测 定可 在接种部 位产生 高度 隆 起的 乳白色 菌脓，最后 组织 变 褐坏死，但不 发臭；能再 次 从接种 发病 部位 分离 到目标病原 菌，确定 病原 菌为 梨枯梢 病菌。8.1.3 ELISA 检测 结果 判定 在 阴 性对 照OD 值0.1，且阳 性 对照OD 值 大于 阴性 对照OD 值2 倍的 前 提下，样品 孔OD 值 大于 阴性对照OD 值2 倍时，判 定为 阳性反 应，即样 品带 有梨 枯梢病 菌；否则 判定 为阴 性反应，即 样品 不带 梨 枯 梢病菌。8.1.4 PCR 检测 结 果判 定 观察电 泳结 果，阳性 对照 在476 bp处 有条 带出 现，且阴性 对照 无条 带，待测 样品在476 bp处有条带出现，判断 样品 中含 有梨 枯梢病 菌；否则 判定 为阴 性反应，即 样品 中不 带梨 枯梢病 菌。8.2 结果报告 8.2.1 监测报 告 记录监 测结 果并 填写 疫 情监测 记录 表（见附 录C）。对监 测结 果进 行整 理 汇总，形 成监 测报 告。8.2.2 检测报告 将实验 室检 测鉴 定结 果填 入植 物有 害生 物样 本检测 报告（见附 录F）。4 9 样品、菌种 保 藏 和无 害化 处理 9.1 样品 保藏 未发现 梨枯 梢病 的样 品保藏6个 月，发现 梨枯 梢病 的 样品保藏1 年，有贸 易纠 纷 的样品 保藏 至少1 年，以备复 验，如涉 及到 贸易 纠纷则 应保 藏到 纠纷 解决 完毕。保藏 样品 要标 明样 品编号、样 品名 称、保 藏 人、保藏日 期和 到期 日期。样 品保藏 期满 后，需经 灭 活 销毁 处 理。9.2 菌种保 藏 分离得 到的 梨枯 梢病 菌菌 株应妥 善保 存，防止 扩散。9.3 无害化 处理 监测和 检测 过程 中使 用 过 的有关 材料 和用 具，在使 用完毕 后须 及时 进行 灭 活 销毁处 理。10 疫情处 置 经监测 或室 内检 测发 现 梨 枯梢病，应 指导 生产、销 售和个 人实 施检 疫处 治及 病害防 治。5 A A 附 录 A（资料 性附 录）试剂及 培养 基的 配制 方法 A.1 ELISA 检测 A.1.1 包被液 Na2HCO3 2.93 g、NaCl 1.59 g，用蒸 馏水 溶解，调 整pH 值到9.6，定容 至1000 mL。A.1.2 洗涤液 Na2HPO4 12H2O 3.58 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.27 g、NaCl 8.01 g、吐 温-20 0.5 g，用 蒸馏 水溶 解，调整pH 值到7.4，定 容至1000 mL。A.1.3 样品提 取液 Na2HPO4 12H2O 3.58 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.27 g、NaCl 8.01 g，用蒸 馏水 溶 解，调整pH 值到7.4，定容至1000 mL。A.1.4 封闭液 脱脂奶 粉5 g，溶解 于100 mL 样品提取液。A.1.5 抗体稀 释液 脱脂奶 粉2.5 g，溶解 于100 mL 洗涤液。A.1.6 TMB显 色液 A.1.6.1 底物缓 冲液 Na2HPO4 12H2O 2.375 g、柠檬酸 1.1675 g，用 蒸馏 水溶解，调 整pH 值到5.0，定容至250 mL。A.1.6.2 TMB母液 10 mg TMB 溶于1 mL 二甲亚砜（DMSO）中，4 保存。A.1.6.3 0.75%H2O2 取25 L 30%H2O2用 超纯 水定容 到1 mL，4避光 保 存。A.1.6.4 显色液 配置：在10 mL 底物缓冲 液 加入100 L TMB 母 液和32 L 0.75%H2O2混匀 后使 用，需要 现配 现用。A.1.7 终止液 浓硫酸 11.1 mL，用蒸馏 水定容 到100 mL。6 A.2 PCR检测 A.2.1 电泳缓 冲液TBE Tris 碱 54 g、硼酸27.5 g、0.5 M EDTA（pH8.0）20 mL，用蒸馏水溶 解定 容至1000 mL。使用时 利用蒸馏 水10 倍稀 释，即为0.5 TBE。A.2.2 琼脂糖 凝胶 在0.5 TBE 工作 液中 加入1%(w/v)的琼脂糖，加热 融 化，冷 却至60 倒入 插入 梳子的 制胶 槽中，冷却凝固 后点 样电 泳。A.2.3 上样缓 冲液 溴百里 酚蓝0.025 g，乙二 醇3 g，溶 解于10 mL 蒸馏水。A.3 YPDA 培 养基 A液：聚 蛋白 胨20 g，酵母 提取物10 g，溶 解于850 mL 水中，121 湿热 灭菌20 min；B 液：葡 萄糖20 g，溶解 于100 mL 水中，115 湿热 灭 菌15 min；C 液：腺 嘌呤 硫酸 盐20 mg，溶解 于10 mL 水中，115 湿热 灭菌15 min；将A、B、C 三 种溶 液混 合，用无 菌水 定容 至1000 mL。如制作 平板，在A 溶液 中 加入15 g 琼 脂粉。7 B B 附 录 B（资料 性附 录）梨枯梢 病基 本信 息 B.1 分类地 位 梨枯梢 病菌（Erwinia pyrifoliae Kim et al.）属于 细菌 界（Bacteria）、变形 菌门（Proteobacteria），-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、肠 杆菌 目（Enterobacteriales）、肠 杆菌科（Enterobacteriaceae），欧文氏 菌 属（Erwinia），在 亚洲 梨（Nashi pear，Pyrus pyrifolia）引起 梨枯 梢 病，为亚 洲梨 树上 的重 要检疫性 病害。B.2 形态特 征 革兰氏 阴性 菌，周生 鞭毛，短杆 状，兼性 厌氧。菌 体大小 为0.8 m（1.0 m 3.0m），以单 个、成对或 短链 形式 存在。B.3 生物学 特性 病菌最 适生 长温 度25 27.5。在YPDA 培 养基 上28 培养48 h后，菌 落大 小 直径为2 mm，呈圆形、白 色、凸起、不 透明。B.4 发病规 律 病原菌 在病 树上 越冬。翌 年春天 在潮 湿环 境中，病 原菌活 跃繁 殖，可以 通过 蜜蜂、蚂蚁 等昆 虫 粘 带传播，也 可 以通 过雨 水飞 溅传播。病 原菌 通过 花器、自然 孔口（皮孔、气 孔）或伤 口侵 入，在 嫩枝 中 的胞间或 者导 管中 扩散。B.5 田间症 状特 征 B.5.1 花簇与 嫩枝 花簇上 的症 状一 般在 花瓣 脱落 1 周2 周 后表 现。花 器被害 后呈 萎蔫 状，深褐 色，并向 下蔓延 至 花柄，使 花柄 呈水 渍状，然 后 皱缩变 成黑 褐色，脱 落或 干枯后 仍悬 挂在 树枝 上，花梗上 有橘 红色 菌脓 渗出。嫩枝的 症状 与花 期相 似，但病害 发展 更快。嫩 枝尖 可迅速 枯萎 形成“牧 羊鞭”状。感病 叶片 常 发 黑 沿 中脉扩展 至完 全坏 死。许多 患病的 嫩芽、梢 和树 叶，使一棵 树看 似被 烧焦，枯 萎。B.5.2 树干与 枝条 新枝皮 色变 黑，水渍 状，枝尖萎 蔫 下 弯，呈“牧羊 鞭”状；多 年生 枝中 部皮 层凹陷 向前 向后 蔓 延，造成大 枝、中心 干整 枝或 整株死 亡；枝条、骨 干枝 和主干 表皮 流出 锈红 色液 体；拨 开皮 层韧 皮、木 质 部组织呈 黄褐 色。8 B.5.3 叶片 沿主脉 或沿 叶边 缘及 两脉 之间形 成黑 褐色 的病 斑。随着变 色加 深，叶 片卷 曲 萎缩下 垂，干 枯挂 在枝上不脱 落，叶柄 变黑，叶 柄上有 桔红 色菌 浓。B.5.4 果实 未成熟 的果 实受 侵染 时出 现水渍 状，然后 呈褐 色收 缩，逐 渐变 黑，受侵 染果 实 不易 脱落。幼果出现黑色斑 点、斑块，局 部或 整个表 皮先 变黑，后 延伸 至果肉，果 柄通 常有 菌脓；果实 生长 期间 一 直 不 断 随枝发病 萎焉 皱缩 挂在 树上 失去商 品性。9 C C 附 录 C（规范 性附 录）疫情监 测记 录表 调查单 位：调 查时间：编号 作物品种 调查地点 调查株数 疑似症状 表现株 数 监测结果 调查人（签 字）：10 D D 附 录 D（资料 性附 录）梨枯梢 病菌 双抗 ELISA 检 测程序 D.1 包被 捕 获抗 体 提 前按 照市 售产 品要求 用包 被液 进行 稀释，然后每 孔加 入100 L 包被于96孔 酶标 板上。4 孵育12 h16 h 后弃 去孔 中 液体，用 洗 涤液 加满 每个 反应孔，静 置1 min 2 min 后，将 洗涤 液 缓 慢倒 出，重新加 入新的 洗涤 液，重 复上述 步骤3 次。洗 板完 成 后将 酶 标板 倒 置于 干净的 吸水纸 上，吸 干反 应孔 中的水分。D.2 封闭 酶标板 中每孔 加入200 L 封闭液，37 封闭1.5 h 后 弃去封 闭液，用洗 涤液 洗板3次，每次2 min。洗板完成 后将 酶标 板 倒 置于 干净的 吸水 纸上，吸 干反 应孔中 的水 分。D.3 加样 加入梯 度稀 释的 梨枯 梢病 菌菌液，每孔100 L。室温孵育1 h 后弃 去 孔 中液 体，用 洗 涤液 洗板4次，每次2 min。洗 板完 成后 将 酶标板 倒置 于干 净的 吸水 纸上，吸干 反应 孔中 的水 分。D.4 加 酶标 检测 抗体-HRP 复合 物 每孔加入100 L 检测 抗体-HRP 复 合物，抗体HRP 复 合物 提前按照市售产品要 求 进行稀释，置于 保湿容器 中，25 孵育1 h。用洗涤 液洗板4 次，每次2 min。洗板完 成后 将 酶 标板 倒置于 干净 的吸 水纸 上，吸干反 应孔 中的 水分。D.5 显色 提 前15 min 配好 显色 液，每孔加 入100 L，25避光 显色20 min 至阳性 对照 显色。D.6 终止反 应 显色后 在每 孔加 入50 L 终止液。D.7 测定 在波长450 nm 下用酶标 仪 测量结 果，读取 各孔 溶液 的光密 度值（OD 值），记 录结果。11 E E 附 录 E（资料 性附 录）梨枯梢 病 菌 PCR 检测 程序 E.1 DNA提取 挑取少 量分离 到的 病原菌 配制成108CFU/mL 悬浮液，1 mL 菌悬液按照市 售DNA 提取 试剂盒 要求 提取DNA。提取 后用 蛋白/核 酸分析 仪鉴 定DNA 质量，当A260/A280比 值为1.82.0 时，适 合于PCR 扩增。E.2 引物 上游引 物（HrcCF）:5-GACGTTTGCACCTGGAAACCG-3；下游引 物（HrcCR）:5-GCGGTAGGTAATCAAGGCCAC-3；扩增产 物为476 bp。E.3 反应体 系 见表E.1.E.4 反应条 件 94 变性3 min；进 入循 环，94 变性30 s，62 退火30 s，72 延伸30 s，30 个循环；最 后72 延伸5 min。如采用 市售 的试 剂盒，按 照说明 作适 当调 整。E.5 电泳分 析 取5 L PCR 扩 增产 物与1 L 的6 上样缓 冲液 混合 均匀，上样 于1.5%琼 脂糖 凝胶 中，80 V 电泳1 h，溴化乙 锭（EB）染色20 min 30 min 后，凝胶 成像 系 统中观 察，记录 观察 结果。反应组 成 体积，L 10 PCR buffer 5 25 mm MgCl2 3 25 mm dNTP 2 引物（20 m）1 5 U/L Taq DNA 聚合 酶 0.5 模板DNA 2 ddH2O 34 总体积 50 12 F F 附 录 F（规范 性附 录）植物有 害生 物样 本检测 报告 植物名称 品种名称 植物生育期 样品数量 取样部位 样品来源 送检日期 送检人 送检单位 联系电话 检测方法：检测结果：备注：检测人（签名）：审核人（签名）：检测单位盖 章：年 月 日 注：本单一式三份，检测单位、受检单位和检疫机构各一份。