食品金属包装内壁涂层中三聚氰胺和双酚A迁移量的测定DB13／T 5155-2019.pdf

ICS 67.250 X 08 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 5155 2019 食品金属 包装内壁 涂层中三 聚氰胺和 双酚A 迁移量的测定 2019-12-27 发布 2020-01-28 实施 河 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB13/T 5155 2019 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北省市场监督管理局提出。本标准起草单位：河北省食品检验研究院、河北养元智汇饮品股份有限公司、清华大学、中国人民大学。本标准主要起草人：第一法主要起草人为范素芳、张岩、李强、俞婧、张雷雷、夏军霞、孟志娟、李岩；第二法主要起草人为龙峰、施汉昌、范素芳、张岩、夏军霞。DB13/T 5155 2019 1 食 品金属 包装内壁 涂层中 三聚氰胺 和双 酚 A 迁移量 的测定 1 范围 本标准规定了食品金属包装内壁涂层中三聚氰胺和双酚A迁移量的测定方法。本标准适用于食品金属包装内壁涂层中三聚氰胺和双酚A迁移量的测定。2 规范性 引用 文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 5009.156 食品安全国家标准 食品接触材料及制品迁移实验预处理方法通则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB 31604.1 食品安全国家标准 食品接触材料及制品迁移试验通则 第一法 气 相色 谱-串 联质 谱法 3 原理 食品金属包装内壁涂层采用食品模拟物浸泡，三聚氰胺和双酚A迁移到浸泡液中，取一定量的模拟物浸泡液经提取、净化、衍生后进气相色谱-质谱仪测定，溶液中三聚氰胺和双酚A通过毛细管色谱柱分离，外标法定量。4 试剂 和 材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。试验中容器及转移器具应避免使用塑料材质。4.1 试剂 4.1.1 甲醇：色谱纯。4.1.2 乙腈：色谱纯。4.1.3 吡啶：色谱纯。4.1.4 衍生化试剂：N,O-三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷（TMCS）（99+1，V/V），色谱纯。4.1.5 植物油：符合GB 5009.156 的要求。4.2 试剂配 制 DB13/T 5155 2019 2 4.2.1 水基、酸性、酒精类、油基食品模拟物的配制：按GB 5009.156 操作。4.3 标准品 4.3.1 三聚氰胺标准品（C3H6N6，CAS 号：108-78-1），纯度99.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。4.3.2 双酚A标准品（C15H16O2，CAS 号：80-05-7），纯度99.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。4.4 标准溶 液配 制 4.4.1 三聚氰胺标准储备液（1 mg/mL）：准确称取 0.0500 g（精确至0.1 mg）三聚氰胺标准物质到50 mL容量瓶，加入40 mL 水，在水浴（温度为 70）中超声15 min30 min，使三聚氰胺能够充分溶解，冷却至室温后用水定容，将溶液转移至棕色试剂瓶中，4 20 条件下保存，6个月内浓度保持稳定。4.4.2 双酚A标准储备液（1 mg/mL）：准确称取 0.0500 g（精确至0.1 mg）双酚A标准物质到50 mL容量瓶，用甲醇溶解、定容至刻度，摇匀，静置，将溶液转移至棕色试剂瓶中，0 4 条件下保存，6个月内浓度保持稳定。4.4.3 三聚氰胺和双酚 A混合标准工作液（10 g/mL）：精密量取 1 mg/mL 的三聚氰胺标准储备液和双酚A标准储备液各 1.0 mL，于 100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，静置。将溶液转移至棕色玻璃瓶中，0 4 保存，有效期1个月。4.5 材料 4.5.1 有机相微孔滤膜：0.22 m。5 仪器与 设备 5.1 气相色谱-三重四级杆质谱联用仪：配有电子轰击源（EI）。5.2 分析天平：感量 0.1 mg和0.01 mg。5.3 涡旋振荡器。5.4 氮吹仪:可控温。6 分析步骤 6.1 食品模 拟物 试液 制备 6.1.1 食品模 拟物 浸泡 液的 制备 按照GB 5009.156及GB 31604.1的要求，选择对应的食品模拟物以及迁移实验条件进行迁移试验，可以得到食品模拟物浸泡液。如果食品模拟物浸泡液不能马上进行下一步试验，应将食品模拟物浸泡液于0 4 冰箱中避光保存。在食品模拟物浸泡液温度与室温一致后，进行下一步试液的制备。DB13/T 5155 2019 3 6.1.2 食品模 拟物 试液 的制 备 6.1.2.1 水性、酸性、酒 精类 食品 模拟物 试液 准确称取迁移试验后得到的水性、酸性、酒精类食品模拟物浸泡液2 mL，待用。6.1.2.2 油性食 品模 拟物 试液 分别称取5 g（精确至0.01 g）油基食品模拟物至具塞玻璃试管中，加入5 mL正己烷，混匀，加入5 mL甲醇-水混合溶液（1+1，V/V），涡旋振荡2 min，静置分层。吸取下层水溶液2 mL，待用。6.1.3 空白试 液的 制备 未与食品金属包装内壁涂层接触的水性、酸性、酒精类食品模拟物按照6.1.2.1操作，油性食品模拟物按照6.1.2.2操作，过滤后所得为空白试液。6.2 提取 取食品模拟物标准工作溶液、食品模拟物试液、空白试液2 mL于15 mL离心管中，准确加入4 mL乙腈，剧烈振荡提取10 min，4000 r/min离心10 min，吸取清液4 mL于15 mL离心管中，待净化。6.3 净化 将待净化的清液置于-20 低温箱中冷冻30 min至分层，准确吸取上层清液2.0 mL，于70 水浴中氮气吹干，待衍生化。6.4 衍生化 取上述氮气吹干残留物，加入500 L的吡啶和100 L衍生化试剂（4.1.4），混匀,置70 5 烘箱中，衍生反应30 min,待测。6.5 仪器参 考条 件 6.5.1 色谱条 件 色谱参考条件如下：a)色谱柱：HP-5MS 毛细管色谱柱(30 m0.25 mm，0.25 m)，或相当者；b)载气：氦气，流速 1.2 mL/min；c)进样口温度：250；d)进样量：1.0 L，不分流进样，溶剂延迟 4 min；e)程序升温：初始柱温75，保持1 min，以 30/min升至220，再以5/min升至280，保持2 min。6.5.2 质谱条 件 质谱参考条件如下：a)电离方式：电子轰击电离（EI)；b)电离能量：70 eV；c)离子源温度：230。d)扫描方式：多反应监测模式(multi-reaction monitoring，MRM)，分析物的质谱参数见表 1。三聚氰胺和双酚A总离子流图见附录 A。DB13/T 5155 2019 4 表 1 分析 物的 质谱 参数 分析物名称 母离子（m/z)定量离子（m/z)碰撞能（V）子离子（m/z)碰撞能（V）双酚 A 356.8 73.0 40 191.0 20 三聚氰胺 342.0 327.0 15 171.0 15 6.6 食品模 拟物 试样 溶液 的测 定 6.6.1 食品模 拟物 标准 工作 溶液 的制备 6.6.1.1 水性、酸性、酒 精类 食品 模拟物 标准 工作 溶液 分别吸取三聚氰胺和双酚A混合标准工作溶液（4.4.3）0 mL、0.01 mL、0.025 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.25 mL于50 mL容量瓶中，分别用水性食品模拟物定容，其中三聚氰胺和双酚A的浓度分别为0 g/L、2 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L、40 g/L、50 g/L。采用相同方式，分别用酸性、酒精类食品模拟物配制同样浓度系列的三聚氰胺和双酚A标准工作溶液。6.6.1.2 油性食 品模 拟物 标准 工作 溶液 分别称取5 g（精确至0.01 g）油基食品模拟物至7个具塞玻璃试管中，分别移取0 L、1 L、3 L、5 L、10 L、20 L、25 L三聚氰胺和双酚A混合标准工作溶液（4.4.3），得到浓度分别为0 g/kg、2 g/kg、6 g/kg、10 g/kg、20 g/kg、40 g/kg、50 g/kg的标准工作溶液。分别在每个试管中再加入5 mL正己烷，混匀，加入5 mL甲醇-水混合溶液（1+1，V/V），涡旋振荡2 min，静置分层。吸取下层水溶液2 mL，待用。6.6.2 定性测 定 按照仪器参考条件(6.5)测定食品模拟物试样溶液和标准工作溶液，如果食品模拟物试样溶液的质量色谱峰保留时间与标准溶液在2.5%范围内；定性离子对的相对丰度与浓度相当的混合基质标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表2的规定，则可判断样品中存在相应的待测物。表 2 定性 测定 时相 对离 子 丰度的 最大 允许 偏差 相对离子丰度，k/%k50 20k50 10k20 k10 允许的相对偏差/%20 25 30 50 6.6.3 标准曲 线的 制作 以食品模拟标准工作溶液中三聚氰胺和双酚A浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作溶液，得到线性方程。6.6.4 定量测 定 将试样溶液注入气相色谱-质谱联用仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中三聚氰胺和双酚A的浓度。6.7 空白试 验 空白试验系指除不加试样外，采用完全相同的分析步骤、试剂和用量，进行平行操作。DB13/T 5155 2019 5 7 分析结 果的 表述 7.1 食品模 拟物 试液 中三 聚氰 胺、双 酚 A 浓度 的计 算 由标准曲线得到食品模拟物中三聚氰胺和双酚A的浓度，分以下两种情况计算：a)水性、酸性、酒精类食品模拟物试液中三聚氰胺、双酚 A浓度按式(1)计算。（1）式中：Xi-试样中三聚氰胺、双酚A的含量，单位为毫克每升（mg/L）；-上机样液中三聚氰胺、双酚A的含量，单位为毫克每升（mg/L）；V-定容体积，单位为毫升（mL）；K-稀释倍数；v-样品体积，单位为毫升（mL）。b)油性食品模拟物试液中三聚氰胺、双酚 A浓度按式(2)计算。（2）式中：Xi-样品中三聚氰胺、双酚A的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；-上机样液中三聚氰胺、双酚A的含量，单位为毫克每升（mg/L）；V-定容体积，单位为毫升（mL）；K-稀释倍数；m-样品质量，单位为克（g）。7.2 三聚氰 胺、双 酚A 特 定迁 移量的 转化 计算 得到的食品模拟物试液中三聚氰胺和双酚A浓度，按GB 5009.156进行迁移量的计算，得到食品模拟物中三聚氰胺和双酚A的迁移量。结果保留三位有效数字。8 精密度 重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。9 检出限 和定 量限 本方法对水性、酸性、酒精类食品模拟物中三聚氰胺、双酚A的检出限为0.05 mg/L，油性食品模拟物中三聚氰胺、双酚A的检出限为0.05 mg/kg。本方法对水性、酸性、酒精类食品模拟物中三聚氰胺、双酚A的定量限为0.1 mg/L，油性食品模拟物中三聚氰胺、双酚A的定量限为0.1 mg/kg。第二法 倏 逝波 荧光 传感 器 法 10 原理 DB13/T 5155 2019 6 将待测物（三聚氰胺和双酚A）和牛血清白蛋白合成的包被抗原（SM-BSA、BPA-BSA）共价结合到光纤探头表面。激发光在光纤谈都内中以全内反射方式传播并在其表面上形成倏逝波场，该倏逝波可以激发与包被抗原特异性结合抗体上标记的荧光分子。基于间接竞争免疫分析原理，利用荧光强度与待测样品中目标物浓度的线性关系实现其定量检测。11 试剂和 材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。试验中容器及转移器具应避免使用塑料材质。11.1 试剂 11.1.1 甲醇：色谱纯。11.2 试剂配 制 11.2.1 水基、酸性、酒精类、油基食品模拟物的配制：按GB 5009.156 操作。11.3 标准品 11.3.1 三聚氰胺标准品（C3H6N6，CAS 号：108-78-1），纯度99.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。11.3.2 双酚A标准品（C15H16O2，CAS号：80-05-7），纯度99.0%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。11.3.3 三聚氰胺荧光标记抗体：Cy5.5荧光标记抗体，浓度为 0.2 mg/L。11.3.4 双酚A荧光标记抗体：Cy5.5荧光标记抗体，浓度为0.5 mg/L。11.4 标准溶 液配 制 11.4.1 三聚氰胺标准储备液（1 mg/mL）：准确称取 0.0500 g（精确至 0.1 mg）三聚氰胺标准物质到50 mL容量瓶，加入 40 mL水，在水浴（温度为70）中超声 15 min30 min，使三聚氰胺能够充分溶解，冷却至室温后用水定容，将溶液转移至棕色试剂瓶中，4 20 条件下保存，6个月内浓度保持稳定。11.4.2 双酚A标准储备液（1 mg/mL）：准确称取 0.0500 g（精确至0.1 mg）双酚A标准物质到 50 mL容量瓶，用甲醇溶解、定容至刻度，摇匀，静置，将溶液转移至棕色试剂瓶中，0 4 条件下保存，6个月内浓度保持稳定。11.4.3 三聚氰胺标准工作液（10 g/mL）：精密量取 1 mg/mL的三聚氰胺标准储备液 1.0 mL，于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，静置。将溶液转移至棕色玻璃瓶中，0 4 保存，有效期1个月。11.4.4 双酚A标准工作液（10 g/mL）：精密量取 1 mg/mL的双酚A标准储备液 1.0 mL，于 100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，静置。将溶液转移至棕色玻璃瓶中，0 4 保存，有效期1个月。11.5 材料 DB13/T 5155 2019 7 11.5.1 有机相微孔滤膜：0.22 m。12 仪器与 设备 12.1 倏逝波荧光传感器（含特异性传感探头）。12.2 分析天平：感量0.1 mg和0.01 mg。13 分析步骤 13.1 食品模 拟物 试液 制备 13.1.1 食品模 拟物 浸泡 液的 制备 按照GB 5009.156及GB 31604.1的要求，选择对应的食品模拟物以及迁移实验条件进行迁移试验，可以得到食品模拟物浸泡液。如果食品模拟物浸泡液不能马上进行下一步试验，应将食品模拟物浸泡液于0 4 冰箱中避光保存。在食品模拟物浸泡液温度与室温一致后，进行下一步试液的制备。13.1.2 食品模 拟物 试液 的制 备 13.1.2.1 水性、酸性、酒 精类 食品 模拟物 试液 准确称取迁移试验后得到的水性、酸性、酒精类食品模拟物浸泡液2 mL，待用。13.1.2.2 油性食 品模 拟物 试液 分别称取5 g（精确至0.01 g）油基食品模拟物至具塞玻璃试管中，加入5 mL正己烷，混匀，加入5 mL甲醇-水混合溶液（1+1，V/V），涡旋振荡2 min，静置分层。吸取下层水溶液2 mL，待用。13.1.3 空白试 液的 制备 未与食品金属包装内壁涂层接触的水性、酸性、酒精类食品模拟物按照13.1.2.1操作，油性食品模拟物按照13.1.2.2操作，过滤后所得为空白试液。13.2 食品模 拟物 试样 溶液 的测 定 13.2.1 食品模 拟物 标准 工作 溶液 的制备 13.2.1.1 水性、酸性、酒 精类 食品 模拟物 标准 工作 溶液 分别吸取三聚氰胺标准工作溶液（11.4.3）0 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、1.0 mL于50 mL容量瓶中，用水性食品模拟物定容，其中三聚氰胺和双酚A的浓度分别为0 g/L、10 g/L、20 g/L、40 g/L、80 g/L、100 g/L、200 g/L。采用相同方式，分别用酸性、酒精类食品模拟物配制同样浓度系列的三聚氰胺标准工作溶液。分别吸取双酚A标准工作溶液（11.4.4）0 mL、0.025 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.25 mL、0.5 mL于50 mL容量瓶中，用水性食品模拟物定容，其中双酚A的浓度分别为0 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L、40 g/L、50 g/L、100 g/L。采用相同方式，分别用酸性、酒精类食品模拟物配制同样浓度系列的双酚A标准工作溶液。DB13/T 5155 2019 8 13.2.1.2 油性食 品模 拟物 标准 工作 溶液 分别称取5 g（精确至0.01 g）油基食品模拟物至7个具塞玻璃试管中，分别移取0 L、5 L、10 L、20 L、40 L、50 L、100 L三聚氰胺标准工作溶液（11.4.3），得到浓度分别为0 g/kg、10 g/kg、20 g/kg、40 g/kg、80 g/kg、100 g/kg、200 g/kg的标准工作溶液。分别在每个试管中再加入5 mL正己烷，混匀，加入5 mL甲醇-水混合溶液（1+1，V/V），涡旋振荡2 min，静置分层。吸取下层水溶液2 mL，待用。分别称取5 g（精确至0.01g）油基食品模拟物至7个具塞玻璃试管中，分别移取0 L、2 L、5 L、10 L、20 L、25 L、50 L双酚A混合标准工作溶液（11.4.4），得到浓度分别为0 g/kg、4 g/kg、10 g/kg、20 g/kg、40 g/kg、50 g/kg、100 g/kg的标准工作溶液。分别在每个试管中再加入5 mL正己烷，混匀，加入5 mL甲醇-水混合溶液（1+1，V/V），涡旋振荡2 min，静置分层。吸取下层水溶液2 mL，待用。13.3 空白试 验 空白试验系指除不加试样外，采用完全相同的分析步骤、试剂和用量，进行平行操作。14 分析结 果的 表述 14.1 标准曲 线的 制作 取200 L食品模拟物标准工作溶液（13.2.1）与200 L的三聚氰胺Cy5.5荧光标记抗体（浓度物0.2 mg/L）混合，另取200 L食品模拟物标准工作溶液（13.2.1）与200 L的双酚ACy5.5荧光标记抗体（浓度物0.5 mg/L）混合，反应5 min。测定不同浓度待测物响应值。以Cy5.5标记抗体制作竞争性抑制曲线，标准曲线以双酚A、三聚氰胺浓度的对数绘制。14.2 食品模 拟物 试液 中三 聚氰 胺、双 酚 A 浓度 的计 算 14.2.1 得到的试样溶液中三聚氰胺和双酚 A浓度，按 GB 5009.156进行迁移量的计算，得到食品模拟物中三聚氰胺和双酚 A的迁移量。结果保留三位有效数字。a)水性、酸性、酒精类食品模拟物试液中三聚氰胺、双酚 A浓度按式(3)计算：（3）式中：Xi-试样中三聚氰胺、双酚A的含量，单位为克每升（g/L）；-上机样液中三聚氰胺、双酚A的含量，单位为微克每升（g/L）；V-定容体积，单位为毫升（mL）；K-稀释倍数；v-样品体积，单位为毫升（mL）。b)油性食品模拟物试液中三聚氰胺、双酚 A浓度按式(4)计算：（4）式中：Xi-样品中三聚氰胺、双酚A的含量，单位为微克每千克（g/kg）；-上机样液中三聚氰胺、双酚A的含量，单位为微克每升（g/L）；DB13/T 5155 2019 9 V-定容体积，单位为毫升（mL）；K-稀释倍数；m-样品质量，单位为克（g）。15 精密度 重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。16 检出限 和定 量限 本方法对水性、酸性、酒精类食品模拟物中三聚氰胺、双酚A的检出限分别为5.4 g/L和0.34 g/L，油性食品模拟物中三聚氰胺、双酚A的检出限分别为5.4 g/kg和0.34 g/kg。本方法对水性、酸性、酒精类食品模拟物中三聚氰胺、双酚A的定量限分别为12.6 g/L和0.67 g/L，油性食品模拟物中三聚氰胺、双酚A的定量限分别为12.6 g/kg和0.67 g/kg。DB13/T 5155 2019 10 附 录 A（资料 性附 录）三聚氰 胺和 双酚A的 总离 子 流图 三聚氰胺和双酚A总离子流图见图A.1。RT:0.00-24.490 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Time(min)05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance10.347.6810.42 5.66 8.86 19.41 17.28 4.91 18.56 19.86 16.83 15.47 9.42 14.97 6.03 13.82 13.35 20.65 7.12 11.34 8.49 21.51 4.57 3.09 22.58 23.37 0.11 2.38 1.15NL:3.05E7TIC MS yang-1 图A.1 三聚 氰胺 和双 酚A（浓度 20 g/L）的总 离子 流 图 _