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I C S 6 5.0 2 0.2 0B 0 5黑 龙 江 省 地 方 标 准DB23D B 2 3/T 2 6 8 5 2 0 2 0水 稻 遗 传 性 状 定 向 突 变 育 种 技 术 规 程2 0 2 0-0 9-1 1 发 布黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局发 布2 0 2 0-1 0-1 0 实 施D B 2 3/T 2 6 8 5-2 0 2 0I前 言本 标 准 依 据 G B/T 1.1-2 0 0 9 编 写 规 则 起 草。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 农 村 厅 提 出。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 标 准 化 技 术 委 员 会 归 口。本 标 准 起 草 单 位：黑 龙 江 省 农 业 科 学 院 耕 作 栽 培 研 究 所、中 国 科 学 院 遗 传 与 发 育 生 物 学 研 究 所。本 标 准 主 要 起 草 人：来 永 才、朱 祯、王 锋、孟 英、唐 傲、张 磊、张 喜 娟、李 平、董 文 军、陈 在 杰、刘 猷 红、王 立 志、陈 丽 华、姜 树 坤、刘 凯、刘 琦、姜 辉、任 洋、董 德 建。D B 2 3/T 2 6 8 5-2 0 2 01水 稻 遗 传 性 状 定 向 突 变 育 种 技 术 规 程1 范 围本 标 准 规 定 了 水 稻 遗 传 性 状 定 向 突 变 育 种 技 术 的 术 语 和 定 义、基 本 要 求、技 术 流 程 和 操 作 步 骤。本 标 准 适 用 于 水 稻 遗 传 性 状 定 向 突 变 育 种。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的。凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。G B/T 1 7 3 1 6 水 稻 原 种 生 产 技 术 操 作 规 程G B/T 1 9 4 8 9 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1遗 传 性 状 定 向 突 变对 目 的 基 因 特 定 D N A 片 段 进 行 突 变，使 遗 传 性 状 发 生 定 向 突 变 的 操 作 技 术。3.2定 向 突 变 系 统遗 传 性 状 定 向 突 变 技 术 主 要 使 用 的 是 C R I S P R/C a s 系 统。C R I S P R/C a s 系 统 是 成 簇 的 规 律 间 隔 的 短 回 文重 复 序 列/成 簇 的 规 律 间 隔 的 短 回 文 重 复 序 列 关 联 蛋 白 系 统，其 广 泛 存 在 于 细 菌 及 古 生 菌 中,是 机 体 长期 进 化 形 成 的 R N A 指 导 的 降 解 入 侵 病 毒 或 噬 菌 体 D N A 的 适 应 性 免 疫 系 统。4 基 本 要 求4.1 设 施 和 设 备实 验 室 设 施、设 备 和 试 验 场 所 符 合 G B/T 1 9 4 8 9 中 生 物 安 全 防 护 水 平 一 级 的 要 求。4.2 操 作 人 员实 验 操 作 人 员 应 通 过 必 要 的 实 验 技 术 和 生 物 安 全 管 理 规 范 的 培 训。4.3 记 录应 包 括 但 不 限 于 试 验 开 始 和 结 束 的 时 间，材 料 名 称、来 源、编 号、保 存 信 息、目 的 基 因 序 列 信 息、载 体 结 构、表 型 鉴 定 和 突 变 后 代 的 检 测 结 果 等。4.4 其 他利 用 遗 传 性 状 定 向 突 变 技 术 进 行 水 稻 育 种 的 过 程 应 符 合 相 应 法 律 法 规 的 规 定。D B 2 3/T 2 6 8 5-2 0 2 025 技 术 流 程技 术 流 程 应 符 合 图 1 规 定：图 1 遗 传 性 状 定 向 突 变 育 种 技 术 流 程 图6 操 作 步 骤6.1 目 标 基 因 突 变 位 点 设 计比 对 受 体 材 料 全 基 因 组 序 列，根 据 目 标 性 状 基 因 的 来 源、序 列 和 载 体 启 动 子 的 种 类 选 择 适 合 的 软 件设 计 基 因 上 的 突 变 位 点。6.2 定 向 突 变 载 体 的 构 建对 基 因 进 行 突 变 位 点 预 测，设 计 相 应 引 物。根 据 遗 传 性 状 定 向 突 变 的 方 式 和 对 象 选 择 适 宜 的 载 体，经 酶 切 线 性 化、T 4 连 接 酶 进 行 连 接、转 化 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 和 测 序 鉴 定，构 建 C R I S P R/C a s 9 表 达 载体。6.3 遗 传 工 程 转 化将 正 确 连 接 的 重 组 载 体 转 化 至 农 杆 菌，利 用 农 杆 菌 介 导 的 方 法 转 化 受 体 水 稻 的 愈 伤 组 织，筛 选 培 养获 得 再 生 的 水 稻 植 株。6.4 突 变 体 的 筛 选 和 鉴 定6.4.1 筛 选 鉴 定 引 物 的 设 计根 据 筛 选 标 记、载 体 特 异 序 列、目 的 基 因 序 列 和 突 变 位 点，利 用 专 业 软 件 设 计 检 测 引 物。6.4.2 突 变 植 株 的 鉴 定提 取 突 变 当 代 水 稻 的 基 因 组 D N A，利 用 筛 选 标 记 和 载 体 特 征 引 物 对 突 变 后 代 进 行 P C R 扩 增，均 能 扩增 出 目 的 条 带 的 为 突 变 植 株。6.4.3 突 变 位 点 分 析对 突 变 植 株 的 基 因 突 变 位 点 区 域 进 行 测 序，鉴 定 突 变 位 点 的 突 变 类 型，选 择 有 效 的 突 变 类 型 单 株 进行 种 子 收 获 并 继 续 种 植。D B 2 3/T 2 6 8 5-2 0 2 036.4.4 突 变 体 表 型 分 析从 有 效 的 定 向 突 变 体 后 代 中 选 择 纯 合 株 系 进 行 突 变 位 点 表 型 测 定 和 主 要 农 艺 性 状 调 查，田 间 记 载 项目 参 考 G B/T 1 7 3 1 6 执 行，结 合 突 变 位 点 遗 传 稳 定 性 的 验 证，可 获 得 稳 定 的 遗 传 性 状 定 向 突 变 水 稻。
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