芋头组培苗生产技术规程DB45／T 1655-2017.pdf

ICS 65.0 20.20 B 21 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 16552017 芋头组培苗生产技术规程 Production technical p ractice for tissue seedling of taro 2017-12-30 发布 2018-01-30 实施广西壮族自治区质量技术监督局 发布 DB 45/T 1 65 5 20 17 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引 用文件.1 3 术语和定 义.1 4 生产设备 和化学试剂.2 5 灭菌操作.2 6 培养室环 境条件控制.2 6.1 温度.2 6.2 湿度.2 6.3 光照.2 7 生产工艺 流程.2 8 生产操作.3 8.1 培养基 配制.3 8.2 外植体 选择及消毒.4 8.3 接种和 增殖培养.4 8.4 组培苗 的生根和培养.5 8.5 组培苗 变异控制及淘汰.5 9 组培苗质 量要求.5 9.1 品种.5 9.2 组培苗 质量要求.5 10 生产管 理规章制度.6 10.1 生产 管理制度.6 10.2 生产 记录及档案建立.6 附录 A（资料 性附录）芋头组培生产常用 M S 培 养基成分及母液配制表.7 附录 B（资料 性附录）芋头组培苗生产常用植物生长调节剂浓度及配制方法.8 DB 45/T 1 65 5 20 17 II DB 45/T 1 65 5 20 17 III 前 言 本标准按GB/T 1.1 2 00 9 给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区农业科学院提出。本标准起草单位：广西农业科学院生物技术研究所、广西标准化协会。本标准主要起草人：闭志强、董伟清、江文、韦绍龙、陈丽娟、罗松、高美萍、何芳练、谢宏昭、韦泽昭、欧昆鹏、唐军、蔡炳华、桂杰、苏宾、蒋慧萍、王艳、张尚文、黄诗宇。DB 45/T 1 65 5 20 17 1 芋头组培苗生产技术规程 1 范围 本标准规定 了芋头(Col o ca si a e sc ul en ta(L.)S ch oo t)组培苗生产的术 语和定义、生产设备和 化 学试剂、消毒灭菌操作、培养室环境控制、生产工艺流程、生产操作、组培苗质量要求、生产管理规章 制度等技术要求。本标准适用于广西境内芋头组培苗生产。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 2 30 6 花卉种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 芋头 又称芋、芋艿。以地下球茎为生产产品的天南星科芋属作物。3.2 母芋 种芋发芽长成新植株，由其基部短缩茎膨大而形成的球茎。3.3 子芋 母芋的腋芽萌发生长并积累营养发育形成的小球茎。3.4 外植体 母芋侧芽和子芋顶芽的顶端生长点。3.5 假植苗 将合格的组培生根苗移栽到装有营养基质的营养杯（育苗袋、育苗盘）中培育成供大田定植栽培的 植株。DB 45/T 1 65 5 20 17 2 3.6 变异株 在 组培生产 过 程 中受到 种 源纯 度、培养基成分、培养条件等 因素 的 影响，导致 生产出的组培植株表 现与原来 品种的植株 在形态特征（如叶色、叶形、球 茎 大小、球 茎 形状、植株高 矮 等）存在 有 明显差 异 的植株。3.7 茎粗 组培苗 假 茎基部的 直径。3.8 株高 组培苗植株 假 茎 底 部 至 植株最长 叶柄顶端 的 距离。3.9 变异率 批次 生产变异株 数与该批次总 生产植株 数 的 百 分 比率。4 生产设备和化学试剂 生产设备和化学试剂按 NY/T 2 30 6 执行。5 灭菌操作 按NY/T 2 30 6 执行。6 培养室环境条件控制 6.1 温度 培养室温度控制 在（26 2）。6.2 湿度 培养室 保持 70 80 的 相 对湿度。6.3 光照 接种 后先在遮 光条件下 暗 培养1 周,后在 光照强度1 00 0 lx 2 00 0 lx，每 天12 h 16 h 条件下培养.；7 生产工艺流程 生产工艺流程 见图 1。DB 45/T 1 65 5 20 17 3 培养基的 选择 母液的配 制及 保存 培养基配制 外植体选择 取材及消毒 接种 萌发培养 分化培养 继代培养(淘汰变异)(取 23代株系 作病毒检测)组培生根苗的选择(淘汰 变异)组培苗根的诱导和培养(淘汰变异)炼苗(淘汰变 异)出厂 图1 组培苗生产工艺流程图 8 生产操作 8.1 培养基配制 8.1.1 培养基选择 根 据 培养 材 料品种类型及生长发 育特 性选择 相 适应的基本培养基种 类 和植物生长调节剂种 类、浓度、配比。芋头组织培养常用MS基 本培养基成分参见附录A。8.1.2 培养基母液配制及保存 8.1.2.1 培养基母液配制 根据生产情况，可以按培养基的成分类型配制成单一化合物母液，也可以配制成 几种化合物的混合 母液参见附录A。DB 45/T 1 65 5 20 17 4 8.1.2.2 培养基母液保存 母液配制 好后，置放入 4 的 冰箱中保存，宜在 30 d 内用 完。存放 期 间，如 有 沉淀，则 废弃，重 配 新母液。8.1.3 培养基的配置 按附件A的 比例 要求，根 据 要配 置 的培养基的 数 量，分 别 量(称)取 母液、糖、添加 剂、固 化剂,先 用 总需 量80 的 蒸馏水混合，边搅拌边加热使固 化剂 熔 化，用1 mo l 的 HC l或 1 mo l N aO H 调 整pH,后 用 蒸馏水定 容至 所 需容 量，趁热 按 每瓶（袋）3 0 mL 的量分 装至 240 ml 的培养 瓶（100 mm 12 0 m m聚丙烯 培养 袋）中并封好瓶（袋装 消毒 盒）盖，经 12 1 20 mi n 高 压蒸汽 消毒,于室温 凝固，存放（3 d 5 d）选择 无 菌 污染 的培养基接种。8.2 外植体选择及消毒 8.2.1 外植体选择 宜从 生长 健 壮、无病虫害、能保证原 品种 优良 性 状 的母芋 侧 芽和 子 芋 顶 芽的 顶端 生长 点上 选 取。8.2.2 外植体取材及消毒 在超净台上截取直径 5 mm 10 mm，长10 mm 20 mm 茎 尖段，先 用70 酒精 浸泡 10 s，无 菌 水冲洗 2 3 次，再 用 0.1 0.2 升 汞 消毒5 min 10 mi n,或 2 次氯酸钠 浸泡 10 mi n 15 mi n,最 后 用 无 菌 水冲洗 3 5 次，沥 干封存 于 经 灭菌的培养 瓶 内 供 接种用。8.3 接种和增殖培养 8.3.1 接种 取经 消毒 处 理的外植体，在无 菌 垫纸（或铝片）上切取 0.3 mm 0.6 mm 的茎 尖 组 织。8.3.2 萌发培养 将切取 的外植体，接种 在 MS+6-BA 0.1 mg/L 1.0 mg/L+NA A0.0 1 mg/L 0.1 mg/L萌 发培养基 上，10 d 15 d后，选择 无污染且已萌 发的外植体 再进行 分化培养。8.3.3 分化培养 将已萌 发的外植体修 整后，接种 在 以MS+6-BA 1 mg/L 3 mg/L+NA A0.0 5 mg/L 0.2 mg/L 为 诱导丛 芽分化培养基 上；也 可 直 接 将 8.3.1 切取 的外植体，接种 在 分化培养基 上进行 培养。8.3.4 继代培养 将侧 芽 或丛 生芽分 切 成 带 有2 3 个 芽 点 的 小块转 接 到继代 培养基 上。继代 培养基是 在 分化培养基基 础上 根 据 培养 材 料的生长发 育 发 育情况，适 当 调 整 培养基 中 植物生长调节剂浓度和 比例，使 增殖 系数 控 制 在 2.5 5.0，植物生长 调节剂的 使 用浓度和作用 参见 附录B。继代周 期控制 在 为20 d 30 d。8.3.5 病毒检测 以单 个 芽 经 组培 而 建立的 丛 生芽 材 料 在继代 前 或继代至 1 2 代形 成株 系时，应及 时取样并采 用 酶联 免疫吸 附 反 应法（EL I SA）或聚合酶链式反 应（PC R）进行 芋花 叶病 毒 检测，或送 有 关 部 门进行病 毒 检测，及 时 淘汰不 合格 的 材 料和株 系。DB 45/T 1 65 5 20 17 5 8.4 组培苗的生根和培养 8.4.1 组培生根材料选择 在继代培养的组培材料中，剪取或切取生长健壮、叶色正常、叶片舒展的无根继代苗，接种在生根 培养基上进行生根培养。8.4.2 组培苗根的诱导和培养 以MS为基本 培养基，添加NA A0.1 mg/L1.0 mg/L诱 导 组培苗生根，芋头组培生产常用生长素的种类 和浓度参见附录B。接种 后，在室内培养20 d30 d。8.4.3 炼苗 移栽前，将培养瓶或培养袋放置在室外自然散射光，25 30 温度 条件下，炼苗30 d45 d，使 茎杆和叶片转绿、根系增多、茎杆变粗，以达到合格标准，成为商品种苗。8.5 组培苗变异控制及淘汰 8.5.1 变异因素控制 8.5.1.1 增殖系数 增殖系数控制在3.05.0。8.5.1.2 继代材料 不应选用愈伤组织分化的芽或植株。8.5.1.3 继代次数 控制在10代 以内。8.5.2 变异材料的淘汰 在生产各阶段，及时淘汰生长异常材料及植株（叶片缺绿、卷曲或不对称；植株畸形、呈细绒毛状 等）。8.5.3 假植苗变异株的淘汰 移栽假植育苗期间，淘汰生长畸形，叶片缺绿的变异株。9 组培苗质量要求 9.1 品种 种源来源清楚，种质纯正、遗传稳定可靠。宜选用通过省级以 上的农作物品种委员会审定的品种。9.2 组培苗质量要求 培养容器内（袋或瓶）的培养基及 生根组培苗 无真菌或细 菌污染，植 株生长形态 正常，符合 表1的 要求。DB 45/T 1 65 5 20 17 6 表1 芋头组培苗质量分级 项目 级别 一级 二级 茎粗(cm)0.3 0.200.29 株高(cm)5.012.0 3.010.0 展开叶片数(张)23 23 白根数(条)2 2 植株颜色 浅绿色浓绿 浅绿色浓绿 1 0 生产管理规章制度 1 0.1 生产管理制度 制定 完 善 的规章制度和操作规程，并 有 效 执行。1 0.2 生产记录及档案建立 生产记录及档案建立内 容宜 包括：母液配制及培养基配制记录、培养基高 压蒸汽 灭菌工作记录、员 工接种工作记录、组培 材 料 继代 和生根 入 出 库 记录、品种 材 料生产档案和产品 销售 记录。DB 45/T 1 65 5 20 17 7 A A 附 录 A（资料性附录）芋头组培生产常用 MS 培养基成分及母液配制表 芋头组培生产常用MS培 养基成分及母液配制表见表A.1。表A.1 芋头组培生产常用 MS 培养基成分及母液配制表 母液编号 成分种类 化合物名称及分子量 规定用量（mg/L）扩大倍数 称取量（mg/L）母液体积（ml/L）1 L 体积吸取 量（mL）母液 1 大量元素 NH 4 NO 3 KNO 3 MgSO 4 7H 2 O KH 2 PO 4 CaCl 2 2H 2 O 1 650 1 900 370 170 440 10 10 10 10 10 16 500 19 000 3 700 1 700 4 400 1 000 100 母液 2 微量元素 MnSO 4 4H 2 O ZnSO 4 7H 2 O H 3 BO 3 KI NaMoO 4 2H 2 O CuSO 4 5H 2 O CoCl 2 6H 2 O 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 100 100 100 100 100 100 100 2 230 860 620 83 25 2.5 2.5 1 000 5 母液 3 Na 2-EDTA FeSO 4 7H 2 O 37.3 27.8 100 100 3 730 2 780 1 000 10 母液 4 甘氨酸 VB1 烟酸 VB6 肌醇 2.0 0.1 0.5 0.5 100 50 50 50 50 50 100 5 25 25 5 000 500 10 蔗糖（mg/L）20 00030 000 固化物（mg/L）3.2 g/L3.5 g/L 琼脂或卡拉胶（凝胶强度 1 300 g/cm 2）pH 5.65.8 水 母液用蒸馏水或重蒸水，生产用的培养基可用去离子水或自来水。DB 45/T 1 65 5 20 17 8 B B 附 录 B（资料性附录）芋头组培苗生产常用植物生长调节剂浓度及配制方法 芋头组培苗生产常用植物生长调节剂浓度及配制方法 见 表B.1。表B.1 芋头组培苗生产常用植物生长调节剂浓度及配制方法 类 别 种 类 常用浓度(mg/L)培养基种类 配制方法 细胞分裂素 6-BA 1.04.0 分化、继代 先用少量 0.5 mol1.0 mol 的盐酸（HCl）溶解，然后 加蒸馏水定容。0.10.15 生根 KT 0.153.0 分化、继代 生长素 IBA 0.050.1 分化、继代 先用少量 1.0 m ol 的 KOH 或 NaOH 溶解，然后加蒸馏水 定容。0.10.5 生根 NAA 0.050.5 分化、继代 0.10.5 生根 植物生长 延缓剂 PP333 0.050.3 继代、生根 先用少量酒精溶解，然后加 水蒸馏定容 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 中华人民共和国广西地方标准 芋头组培苗生产技术规程 DB45/T 1655 2017 广西壮族自治区质量技术监督局统一印刷 版权专有 侵权必究