水产动物病原菌药敏试验和耐药性检测技术规范DB34／T 3399-2019.pdf

ICS 11.220 B 50 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 33992019 水产动物病原菌药敏试验和耐药性 检测技术规范 Standard for Drug sensitivity test and drug resistance test of aquatic pathogenic bacteria 文稿版次选择 2019-11-04发布 2019-12-04实施安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 33992019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽农业大学提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省水产技术推广总站、定远县水务局、明光市水产技术推广站、蒙城县畜牧兽医水产局、安徽海辉水产养殖有限公司、宁国市渔业渔政管理局、定远县海群现代农业发展有限公司、绩溪县农业委员会水产站、望江县水产局、阜南县水产管理局。本标准起草人：彭开松、吴敏、姜守松、范文鲁、赵祖芳、王黎明、贾俊威、付成海、薛贵胜、朱若林、鲍传和、蒋军、魏泽能、檀基良、曹学志、于朝敏。DB34/T 33992019 1 水产动物病原菌药敏试验和耐药性检测技术规范 1 范围 本标准规定了淡水水产动物病原菌药敏试验和耐药性检测的术语与定义、样品采集、病原菌分离与鉴定、纸片扩散法测定抑菌圈直径、微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度、病原菌耐药性检测。本标准适用于淡水水产动物病原细菌药敏试验和耐药性检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.2 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 GB/T 27623.1 渔用抗菌药物药效试验技术规范 第1部分:常量肉汤稀释法药物敏感性试验 WS/T 639 抗菌药物敏感性试验的技术要求 3 术语和定义 下述术语和定义适用于本文件。3.1 活水产动物 Live aquatic animals 具有典型症状和大体病变的活水产动物。3.2 冻水产动物 Frozen aquatic animals 活水产动物断头处死后装入无菌塑料自封袋，在-20冻存 6 h12 h 的水产动物。3.3 冰水产动物 Ice aquatic animals 活水产动物断头处死后装入无菌塑料自封袋，在湿冰中存放 6 h12 h 的水产动物。3.4 死水产动物 Dead aquatic animals 死后在养殖水体中留存 6 h12 h 的水产动物。4 样品采集 DB34/T 33992019 2 4.1 采样器材 手术剪，镊子，解剖盘，无菌棉试子，无菌塑料自封袋，保温采样箱，乳胶手套，网具。4.2 样品数量 具有典型临床症状和大体病变的患病水产动物 35 尾作为分离病菌的样品。如果症状和大体病变复杂，可以适当增加样品数量。4.3 样品质量 样品质量优劣次序为：活水产动物冰水产动物冻水产动物死水产动物。无法获得前三种样品时，可使用死水产动物。样品数量多或动物个体大时，用无菌棉试子充分吸收样品中的体液或直接蘸取小块组织，保存于采样管。样品在 4保温箱或冰盒中运送。5 病原菌分离与鉴定 5.1 样品处置时限 送检样品到达实验室后应立即处理，不能存放过夜。5.2 分离培养基 根据疑似病菌类别，选择预制好的分离培养基（参见附录A和附录B）。5.3 病原菌分离 5.3.1 内脏器官分离法 全身系统性感染病例，体表经 75酒精消毒后，剪除腹壁（鱼类、两栖类、爬行类）或剥离甲壳（虾、蟹和贝类），暴露腹腔或甲壳下的脏器。无菌摘下肝胰腺或脾脏或肾脏，剪一断面涂布到固体培养基表面，划线法分离病菌。5.3.2 体表损伤组织接种法 体表或鳃局灶性损伤病例，选新鲜病灶，在损伤与健康组织的交界处,无菌刮取采集约 1 L 的样品，接种到固体培养基表面，划线法分离病菌 5.4 病原菌物种鉴定 利用形态学、生理生化特性和 16SrDNA 测序等鉴定分离菌。5.5 病原菌致病性鉴定 经毒力基因检测和本动物回归攻毒试验，确定分离菌的致病性。6 纸片扩散法测定抑菌圈直径 6.1 试验器材 纸片扩散法所需试验器材应符合 WS/T 639 的规定。DB34/T 33992019 3 6.2 培养基制备 根据细菌鉴定结果，选择相应固体培养基（见附录D），固体培养基厚度为 4 mm 0.5 mm。固体培养基用无菌塑料自封袋密封后，可在 48放 714 天，用前在 37温箱中除明水。6.3 试验菌液制备 测试菌株包括临床分离病原菌和质控参考菌株（大肠杆菌 ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213）。过夜培养的测试菌株用灭菌生理盐水稀释为 0.5 麦氏浊度（相当于 12108cfu/mL），在 1560 min 内用完。6.4 试验操作过程 灭菌棉试子蘸取上述菌悬液均匀涂布在琼脂表面。在 15 min 之内，将药敏纸片（见附录C）均匀平坦紧贴到平板上（纸片中心间距离至少 3 cm）。倒置平板并在 15 min 内放到培养箱培养,培养皿叠放不超过 5 层。培养温度和时间见附录D。6.5 试验结果判定 培养结束，取出培养皿，放在眼前 30 cm 处，测量抑菌圈直径（单位为 mm）。根据折点值（参见附录E），判断敏感性。如果在培养皿表面仅见单菌落，说明接种量不够，要重新进行试验。7 微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度 7.1 试验器材 除将试管替换为 96 孔微量培养板外，其余所需试验器材应符合 GB/T 27623.1 的规定。7.2 培养基制备 根据细菌鉴定结果，选择相应肉汤培养基（附录D）。7.3 抗菌药物溶液制备 抗菌药物批号、效价、有效期和存储条件，必须明确，并按要求存放在 48的干燥器内。使用药物储存液配制溶剂（附录C）溶解抗菌药物，制备浓度高于 1 g/L 的抗菌药物储存液，抗菌药物储备液在-20可保存一个月。使用药物工作液配制溶剂（附录C）稀释抗菌药物储存液，制备所需的 2 倍比稀释的抗菌药物工作液，并在一天内用完 7.4 细菌工作液制备 过夜培养的测试菌株先用灭菌生理盐水稀释为 0.5 麦氏浊度，再用肉汤稀释 100 倍，使细菌工作液浓度约为 1106cfu/mL。细菌工作液最好在 30 min 内用完，否则应存放在冰上。7.5 试验操作过程 给 96 孔微量培养板做好标记。第 AH 行，每两行为一个重复。第 110 列为测试孔，加入对应浓度的 2 倍比稀释的抗菌药物工作液，每孔 100 L。第 11 列为阳性对照孔，第 12 列为阴性对照孔，二者均加 100 L 灭菌生理盐水。第 111 列加细菌工作液 100 L；第 12 列加肉汤 100 L。上述布板完成后，立即从阳性对照孔中取 10 L 菌悬液加到 10 mL 的生理盐水中，混匀后取 100 L DB34/T 33992019 4 涂布到相应固体培养基表面（见附录D），过夜培养后计数。加盖微量培养板用无菌塑料自封袋密封后，放入培养箱中孵育（培养温度和时间，见附录D）。微孔板的叠层不超过 5 层。7.6 试验结果判定 如果 7.5 中计数的每个培养皿中菌落数量在 2080 之间，则说明细菌工作液浓度比较合适。细菌平板计数和结果认定方法参照 GB 4789.2。微量培养板培养结束后，必须同时满足阳性对照孔浑浊且阴性对照孔清亮，试验结果才有效；否则，试验应重做。以清亮测试孔对应的最小药物工作液终浓度为最小抑菌浓度（MIC）。8 病原菌的耐药性检测 8.1 纸片扩散法 抑菌圈直径小于耐药性折点直径(附录E)，可初步判定该细菌对该药物具有耐药性。8.2 最小抑菌浓度法 最小抑菌浓度大于耐药性折点浓度(附录E)，可初步判定该细菌对该药物具有耐药性。8.3 MBC/MIC比值法 最小抑菌浓度（MIC）结果读取结束后，取 MIC 孔之前清亮孔的各孔培养物 100 L，进行细菌平板计数。当 7.5 中阳性对照孔计数结果为某清亮孔计数结果的 1000 倍时，该清亮孔所对应的药物浓度就是最小杀菌浓度（MBC）。当 MBC/MIC32 时，可判定该菌对某种药物有耐药性。DB34/T 33992019 5 A A 附 录 A（规范性附录）试剂和培养基 A.1 灭菌生理盐水 8.5g NaCl,1L水，121、15min高压蒸汽灭菌，备用。A.2 牛心脑浸出液琼脂（BHIA）20 g 胰蛋白胨，10 g NaCl，10 g 牛心浸粉，4 g 葡萄糖，5 g Na2HPO4，15 g 琼脂，1 L 水，pH 7.4，121、15 min 高压蒸汽灭菌，倾倒平板。A.3 水解酪蛋白（Meller-Hinton）肉汤(MHB)1 g 牛肉粉，1.5 g 可溶性淀粉，17.5 g 酸水解酪蛋白，1 L 水，pH 7.4，121、15 min 高压蒸汽灭菌。灭菌前在 MHB 基础上，添加 15 g 琼脂，灭菌后倾倒平板，即为水解酪蛋白（Meller-Hinton）琼脂（MHA）。A.4 TYEA 1.4 g 胰蛋白胨，0.4 g 酵母膏，0.5 g MgSO47H2O，0.5 g CaCl2H2O，10 g 琼脂，1 L 水，pH 7.2，121、15 min 高压蒸汽灭菌，倾倒平板。A.5 Cytophaga 琼脂 0.5 g 胰蛋白胨，0.5 g 酵母膏，0.5 g 醋酸钠，0.2 g 牛肉膏，10 g 琼脂，1 L 水，pH 7.2，121、15 min 高压蒸汽灭菌,倾倒平板。A.6 Middle-brook-ADH-enrichment-added Middle brook 7H11 0.5 g(NH4)2SO4，1.6 g KH2PO4，1.4g Na2HPO4，0.4 g 柠檬酸钠，0.05 g MgSO4，1.0 g 胰酪蛋白胨，0.001 g ZnSO4，0.001 g CuSO4，0.5g L-谷氨酸钠，0.04 g 柠檬酸铁铵，0.001g 盐酸吡哆醇，0.5 mg 生物素，0.25 mg 孔雀石绿。取上述混合物 5.5 g，加 5 mL 甘油，900 mL 蒸馏水，121、10 min 高压蒸汽灭菌。冷却到 5055时，加入过滤除菌的 OADC 添加剂 100 mL，混匀；然后添加商品化的 ADH(精氨酸双水解酶氯化钠肉汤),混匀备用。如果在高压蒸汽灭菌前，加入 13.5 g 琼脂，后面操作相同，制备得对应固体培养基。OADC 添加剂：5 g 牛血清白蛋白（V 组分）、0.06 mL 油酸、2 g 葡萄糖、0.003 g 触酶、0.85 g NaCl、100 mL 蒸馏水，溶解后过滤除菌。DB34/T 33992019 6 B B 附 录 B（规范性附录）病原菌分离培养基及其培养条件 表B.1 病原菌分离培养基及其培养条件 病原菌 培养基 温度a 时间 革 兰 氏 阴 性 菌 气单胞菌属（Aeromonas）BHIA 1525 24 h48 h 弧菌属（Vibrio）（非专性嗜盐菌株）BHIA 1525 24 h48 h 假单胞菌属（Pseudomonas）BHIA 1525 24 h48 h 邻单胞菌属（Plesiomonas）BHIA 1525 24 h48 h 爱德华菌属（Edwardsiella）柠檬酸杆菌属（Citrobacter）耶尔森菌属（Yersinia）等肠杆菌科 BHIA 1525 24 h48 h 鳗利斯顿氏菌（Listonella anguillarum）BHIA 1525 24 h48 h 黄杆菌属（Flavobacterium）嗜温种用 1/10 MHA；嗜冷种用含 5脱纤马（或羊）血清的 1/10 MHA 25 15 24 h48 h 革 兰 氏 阳 性 菌 链球菌属（Streptococcus）5.0脱纤马(或羊)全血的BHIA 35 16 h18 h 格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）BHIA 35 16 h18 h 分支杆菌属（Mycobacterium）诺卡氏菌属（Nocardia）BHIA 25 48 h 注：a,培养温度最好采用现场测定的发病水温；或者根据嗜冷种、嗜温种和嗜热种，分别使用 15、25和 35培养。DB34/T 33992019 7 C C 附 录 C（规范性附录）常用抗菌药物及其稀释剂 表C.1 常用抗菌药物及其稀释剂 抗菌 药物 纸片扩散法 微量肉汤稀释法 纸片药物含量（g/片）A 药物储存液 配置溶剂 药物工作液 配置溶剂 磺胺嘧啶 25.0B C 蒸馏水 磺胺甲噁唑 25.0 C 蒸馏水 磺胺二甲嘧啶 25.0D C 蒸馏水 磺胺间甲氧嘧啶 25.0D C 蒸馏水 噁喹酸 2.0 E 蒸馏水 氟甲喹 30.0 E 蒸馏水 盐酸环丙沙星 5.0 E 蒸馏水 恩诺沙星 5.0 E 蒸馏水 甲砜霉素 10.0 F 蒸馏水 氟苯尼考 30.0 95.0乙醇 蒸馏水 氨苄青霉素 10.0 磷酸缓冲液G 磷酸缓冲液G 硫酸新霉素 10.0 蒸馏水 蒸馏水 盐酸土霉素 30.0 蒸馏水 蒸馏水 盐酸多西环素 10.0 蒸馏水 蒸馏水 红霉素 10.0 95.0甲醇 蒸馏水 交沙霉素 25.0 95.0乙醇 蒸馏水 注：A，药敏纸片避光低温（一般在-20）保存；-20存放的药敏纸片用前应在室温下解冻后再开瓶；3 天内使用的药敏纸片可以放在 48。B，含 1.25 g 奥美普林（Ormetoprim）。C，加 1/2 量蒸馏水后，滴加 1.0 mol/L NaOH 至全部溶解，蒸馏水定容。D，含 1.25 g甲氧苄啶（Trimethoprim）。E，加 1/2 量蒸馏水后，滴加 2.5 mol/L NaOH 直至全部溶解，蒸馏水定容。F，0.1 N 二甲基甲酰胺溶液。G，0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 8.0）。H，0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0）。配制储存液的溶剂根据需要采用过滤除菌或高压蒸汽灭菌。DB34/T 33992019 8 D D 附 录 D（规范性附录）药敏试验用培养及培养条件 表D.1 药敏试验用培养及培养条件 病原菌 纸片扩散法用培养基a 温 度b 时间 革 兰 氏 阴 性 菌 气单胞菌属（Aeromonas）MHA 1525 24 h48 h 弧菌属（Vibrio）（非专性嗜盐菌株）MHA 1525 24 h48 h 假单胞菌属（Pseudomonas）MHA 1525 24 h48 h 邻单胞菌属（Plesiomonas）MHA 1525 24 h48 h 爱德华菌属（Edwardsiella）柠檬酸杆菌属（Citrobacter）耶尔森菌属（Yersinia）等肠杆菌科 MHA 1525 24 h48 h 鳗利斯顿氏菌（Listonella anguillarum）MHA 1525 24 h48 h 黄杆菌属（Flavobacterium）嗜温种用 1/10 的 MHA 嗜冷种用 Cytophaga 琼脂 25 15 24 h48 h 革 兰 氏 阳 性 菌 链球菌属（Streptococcus）MHA 35 16 h18 h 格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）MHA 35 16 h18 h 分支杆菌属（Mycobacterium）诺卡氏菌属（Nocardia）Middle-brook-ADH-enrichment-added Middle brook 7H11 agar 25 48 h 注：a,微量肉汤稀释法使用的肉汤培养基与纸片扩散法使用的琼脂培养基成分相同，只是后者含琼脂。细菌平板计数所用的固体培养基与纸片扩散法使用的固体培养基相同。b，培养温度最好采用现场测定的发病水温；或者根据嗜冷种、嗜温种和嗜热种，分别使用 15、25和 35培养。DB34/T 33992019 9 E E 附 录 E（资料性附录）常见药物对常见细菌药敏折点的参考值 表E.1 常用药物对气单胞菌属细菌的药敏折点的参考值 药物 MIC折点（mg/L）纸片药物 含量（g）抑菌圈折点（mm）S R S R S R 磺胺及增效剂 磺胺甲噁唑/甲氧苄啶-23.75/1.25 17 12 甲氧苄啶 8 16 5 16 12 氟喹诺酮类 恩诺沙星 0.5 2 10 22 18 环丙沙星 1 4 5 21 15 酰胺醇类 甲砜霉素 8 16 30 18 12 氟苯尼考 8 16 30 16 12 大环内酯类 红霉素 0.5 8 15 23 13 氨基糖甙类 新霉素 2 8 10 18 15 四环素类 土霉素 4 16 30 19 14 强力霉素（多西环素）4 16 30 16 12-内酰胺类 氨苄青霉素-10-DB34/T 33992019 10 表E.3 常用药物对肠杆菌科细菌的药敏折点的参考值 药物 MIC折点（mg/L）纸片含量（g）抑菌圈折点（mm）S R S R S R 磺胺及增效剂 磺胺甲噁唑/甲氧苄啶 1 2 23.75/1.25 18 15 甲氧苄啶 2 4 5 20 17 氟喹诺酮类 恩诺沙星 0.5 2 10 24 18 环丙沙星 0.5 2 5 22 18 酰胺醇类 甲砜霉素 2 8 30 22 18 氟苯尼考 2 8 30 24 18 大环内酯类 红霉素 0.5 4 15 21 18 氨基糖甙类 新霉素 4 16 10 15 12 四环素类 土霉素 1 2 30 23 20 强力霉素（多西环素）1 2 30 23 20-内酰胺类 氨苄青霉素 0.25 1 10 22 18 _