甘蔗白条病菌PCR检测技术规程DB45／T 2029-2019.pdf

ICS 65.0 20.01 B 16 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 20292019 甘蔗白条病菌 PCR 检测技术规程 Detecting technique regulations for pathogen of Xanthomonas albilineans(Ashby)Dowson based on PCR 2019-12-05 发布 2019-12-30 实施广西壮族自治区市场监督管理局 发布 DB 45/T 2 02 9 20 19 I 前 言 本标准按照G B/T 1.1 2 0 09给出的规 则起草。本标准由广西壮族自治区糖业办公室提出并监督实施。本标准由广西糖业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所、广西甘蔗遗传改良重点实验室。本标准主要起草人员：韦金菊、刘昔辉、覃振强、张小秋、张荣华、桂意云、魏春燕、宋修鹏、李 杨瑞、周珊、黄东亮、颜梅新、刘璐。DB 45/T 2 02 9 20 19 1 甘蔗白条病菌 PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了甘蔗白条病菌（X an tho mo na s al bil in ea ns(A s hb y)D ow so n）的 PC R 检 测的原理、试 剂、主要仪器与设备、样品的采集、保存和运输、检测方法和结果描述及判定。本标准适用于甘蔗白条病菌Xa nt hom on as a lb ili ne an s(As h by)Do ws on 的快速检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6 68 2 20 08 分析 实验室用水规格和试验方法 3 原理 利用甘蔗白条病病原白条黄单胞菌1 6-2 3 r R N A 的I T S基因设计的特异性强的引物X a A l b 2-f 3和Xa Al b2-r3，以病原菌的D NA为模板，PCR扩增合成目的片段，从而快速、灵敏、高效 地对甘蔗白 条病菌（X an th om ona s al bi li nea ns(As hb y)Do ws on）进行 检 测。4 试剂 4.1 所用试剂均为分析纯试剂，实验室用水符合 GB/T 66 82 20 0 8 中二级水指 标，其中涉及 PC R 的用 水应符合一级水指标。4.2 液氮。4.3 植物基因组 D NA 提取试剂 盒。4.4 Go ld en v ie w 核酸染料。4.5 2E as yT a q P CR 反应预混 液：市售产品。浓度为1 0 mm ol/L，其 中含有0.0 5 U/L T a q D NA Po ly mer as e、0.4 Mm d NTP Mi xt ure、4 mM Mg2+、2 PC R B u ff er。4.6 1T E缓 冲 液。4.7 1 5 00 bp DNA 分 子质量标准物。4.8 琼脂糖，电泳级。4.9 检测引物序列：上游引 物 X aAl b2-f 3：5-C AC AC AC AC AAT AC AG CA TT GCG G-3；下游引 物 X aAl b2-r 3：5-C CC AA CT TA CTT GA GG CT AT GG-3；预扩增片段大小为 400 b p5 bp。4.10 标样：阳性对照为已确定感染甘蔗白条病菌的样品基因组 D NA；阴 性对 照为确定未感染甘蔗白条 病菌的样品基因组 DN A。DB 45/T 2 02 9 20 19 2 5 主要仪器与设备 5.1 PC R 扩增仪。5.2 凝胶 成 像系统。5.3 核酸蛋 白分析仪 或紫外 分 光光度 计。5.4 台式 高速 冷冻离心机：离心力 12 00 0 g 以 上。5.5 恒温 水 浴锅。5.6 冰箱：2 4、-20、-8 0。5.7 高 压灭 菌 锅。5.8 鼓风干燥箱。5.9 电子天平：感量 0.00 1 g。5.10 微量加 样器：0.1 L 2.5 L、0.5 L 10 L、2 L 20 L、1 0 L 10 0 L、20 L 20 0 L、5 0 L 1 00 0 L。6 样品的采集、保存和运输 6.1 样品采集 可采集 叶 片样品 或 蔗 茎 样品。叶 片取最高可 见肥厚带叶（+1 叶）中 部部 位 叶 片的1.0 g 2.0 g，放 置 于样品 袋 中备用；蔗 茎 取成 熟 期甘蔗的中下 部茎节，去皮挤汁，取 汁 液 置 于 5 m l 10 m l 离心管 中备用。6.2 样品保存和运输 样品 放置 于2 8 条件 下保存，时间4 8 h；长 期 保存，需放置在-8 0 条件 下，不可 反复冻融。长途 运输 时，可采用保 温箱 中 加干冰或 液氮 密封后 运 送。7 检测方法 7.1 样品 D NA 提取 7.1.1 取 叶 片样品的中 间部 分0.1 g，用液氮 冷冻 研 磨至粉末状，按 所 选择 的植物基因组 DN A 提取试剂 盒 推荐 的 操作 方法提取样品 DN A。7.1.2 取蔗 汁 样品 1.5 mL 放 入 2 m L 离心管 中，13 00 0 r/m in 离心 3 m in，弃上清，向沉淀加入 1 00 0 L灭 菌水，13 00 0 r/m in 离心 3 m in，重 复操作 2 次，向沉淀加入 20 L 20 0 L 灭 菌 水。7.2 样品 D NA 质量检测 样品D N A提取 后，用 蛋 白/核酸 分析仪 鉴 定样品D N A 质量，当 A 260/A 280 比值 为1.8 2.0 时，适合于P C R扩增。7.3 P CR 检测 按 表 1的方法 配制 2 5 L 的P CR 扩 增 反 应 体系，反 应 体系 中 各 试剂的 量 可 根据反 应 体系 的 总体体积 进 行适 当调整。PC R扩增 参数：9 4 预 变 性 4 m in；9 4 变 性3 0 s，55 退火 30 s，6 5 延 伸 1 m in，进 行 31 个循环；6 5 延伸 3 m in。空 白对照 为 无 菌一级水。DB 45/T 2 02 9 20 19 3 表1 P CR 扩增反应体系参数 试剂 使用量 25 L反应体系 终浓度 2Easy Taq PCR 反应预混液 12.5 L 1 XaAlb2-f3（10mol/L）1.0 L 0.8 mol/L XaAlb2-r3（10mol/L）1.0 L 0.8 mol/L 模板DNA(25 ng/L)1.0 L 2 ng/L 一级水 9.5 L/总体积 25 L/7.4 扩增产物的电泳检测 7.4.1 称取适量琼脂糖加入 1 TA E缓 冲 液中，加热至完全溶解，配制成1.5的 琼脂糖溶液；稍 适冷 却后倒板，室温下凝固成琼脂糖凝胶。7.4.2 分别取2 L 6 上样缓冲 液和 5 L 的P C R扩 增 产物到新的 P CR 管，振荡混 匀，2 00 0 g离 心5 s。7.4.3 分别将 5 L D NA 分 子量 标准物和 PC R 产物混合液 依次加入琼脂糖凝胶的点样孔后进行电泳，电泳使用的电压为8 0 V，电泳时间为3 0 min。7.5 凝胶成像分析 将琼脂糖凝胶 置 于凝胶 成像系统成 像仪上，根据 DNA分子量 标记判断扩 增出的目的 条带大小，将电 泳结果用拍照系统拍照形成图片文件存档。8 结果描述及判定 8.1 质控标准 阳性对照出现一条大小为400 b p5 bp条带，阴 性对照和空白对照无条带时判定为实验有效。8.2 结果判定 8.2.1 阳性：被检样品泳道出现一条大小为 400 b p5 bp 条带时，判 为 阳性，必要时进行测序。8.2.2 阴性：被检样品没有出现一条大小为 400 b p5 bp 条带，经 重复 2 次 PC R 检测后仍未 出现扩增 条带时，判为阴性。中华人民共和国广西地方标准 甘蔗白条病菌 PCR 检测技术规程 DB45/T 2029 2019 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究