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ICS 65.020.30 B 43 DB33 浙江省 地 方 标 准 DB33/T 2247 2020 鸭坦布苏 病毒 RT-PCR 和实时 荧光定量RT-PCR 检测方法 Method of RT-PCR and the real-time RT-PCR for the detection of duck tembusu virus disease 2020-03-03 发布 2020-04-03 实施 浙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB33/T 22472020 I 前 言 GB/T 1.1-2009 DB33/T 22472020 1 鸭 坦布苏 病毒 RT-PCR 和 实时荧 光定 量 RT-PCR 检测方 法 1 范围-RT-PCR RT-PCR 2 术语和 定义 2.1 鸭坦布 苏病 毒（Duck Tembusu Virus，DTMUV）Ntaya 3 实验条 件 3.1 主要仪 器设 备 3.1.1 PCR 3.1.2 PCR 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.1.8 3.1.9 3.1.10 3.2 试剂 3.2.1 0.01M 0.01 mol/L pH7.4 PBS 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.9 g Na2HPO4 12H2O 0.2 g KH2PO4 800 mL pH 7.4 1 L 30 min 3.2.2 3.2.3 3.2.4 DEPC DEPC 50 L 100 mL 121 15 min 1.5 mL DEPC 3.2.5 75%75 mL DEPC 100 mL-20 DB33/T 22472020 2 3.2.6 EB 1.0 g 100 mL 0.5 g/mL 3.2.7 1TAE 242 g Tris 37.2 g 57.1 mL 1 L 50TAE 20 mL 50TAE 1 L 3.2.8 1%1.0 g 1TAE 100 mL 50 60 EB 0.5 g/mL 5 L 3 mm 5 mm 3.2.9 DNA Marker DL 2000 3.2.10 10 25 g 0.1 g 0.1 g 100 mL 3.2.11 RT-PCR One Step Prime Script RT-PCR Kit Perfect Real Time TAKARA)RT-PCR dNTP RNA 3.2.12 M-MLV 3.2.13 RNA 3.2.14 TaqDNA 3.2.15 dNTPs 3.2.16 RT-PCR,1 RT-PCR 2 表1 RT-PCR 扩 增引 物 DTMUV P1 5-GCAACCAGGCAAAGAGGTCATA-3 DTMUV P2 5-AAGTGAGCCTCATCCATAATGAACA-3 表2 实时荧 光定 量 RT-PCR 引 物 和探针(5-3)DTMUV P3 AAGTCAGGCCAGGGAATCC DTMUV P4 CATGCACCCAGATTTGTTAACC DTMUV FAM-CCGTCATCCAACATC-MGB 4 操作步 骤与 结果 判定 4.1 样品采 集与 处理 4.1.1 组织器 官 5.1.1.1 5.1.1.2 0.1g 1:5 W/W 0.1M PH 7.4 PBS 2 4 3000 r/min 5 min 1 mL 1.5 mL DB33/T 22472020 3 4.1.2 抗凝血、血 清 4.1.2.1 抗凝血 4.1.2.2 血清 3000 r/min 5 min 4.1.3 咽拭子、肛 拭子 0.1 M PH 7.4 PBS 3000 r/min 5 min 4.1.4 样品保 存 4 h-70 4.2 RNA 提取 4.2.1 SPF SPF 4.2.2 RNA RNA a)n+2 1.5 mL DEPC n 1 1 b)250 L 750 L RNA Trizol 1.5 mL 5 min c)200 L 5 min 4 12 000 r/min 15 min d)15 min 4 12 000 r/min 15 min RNA e)500 L 75%2 4 12 000 r/min 5 min f)20 L DEPC g)RNA 2 h RT-PCR-70 4.3 RT-PCR 反应 4.3.1 一步 法RT-PCR 4.3.1.1 RT-PCR 反 应体 系 3 表3 一步 法RT-PCR 反应 体系 RT-PCR 12.5 L DTMUV P1 20 mol/L 0.5 L DTMUV P2 20 mol/L 0.5 L DB33/T 22472020 4 表3（）RNA 2.0 L 1.0 L DEPC 8.5 L 4.3.1.2 反应条 件 50 30 min 94 2 min 94 30 s 56 30 s 72 30 s 30 72 10 min 4.3.2 两步 法RT-PCR 4.3.2.1 反转录 5 L RNA,1 L DTMUV P2 70 5 min 2 min 4 37 1 h cDNA PCR-20 表4 反转录 反应 体系 4 L 0.1 mol/L DTT 2 L 2.5 mmol/L dNTPs 2 L M-MLV 0.5 L RNA 0.5 L DEPC 5 L 4.3.2.2 PCR 反 应体 系 5 PCR 表5 PCR 反 应体 系 1.25 L DTMUV P1 20 mol/L 0.5 L DTMUV P2 20 mol/L 0.5 L 2.5 L 2.5 mmol/L dNTPs 2 L TaqDNA 0.25 L 18 L 4.3.2.3 反应条 件 DB33/T 22472020 5 94 3 min 94 30 s 56 30 s 72 30 s 30 72 10 min 4.3.3 电泳 5 L RT-PCR 0.5 L 10 Loading buffer 1.0%DNA 5 V/cm 30 min 4.3.4 结果判 定 5.3.4.1 567 bp 5.3.4.2 567 bp 567 bp 4.4 实时荧 光定 量 RT-PCR 4.4.1 反应体 系 6 500 r/min 30s PCR 表6 荧光定 量 RT-PCR 体系-PCR Buffer TAKARA ExTaq 2U/DTMUV P3 DTMUV P4 DTMUV RNA/4.4.2 反应条 件 42 5min 95 10 s 95 5 s 58 31 s 40 58 4.4.3 荧光素 的设 定 Report Dye FAM Quencher Dye MGB none 4.4.4 结果判 定 4.4.4.1 阈值设 定 DB33/T 22472020 6 4.4.4.2 质控标 准 Ct 30.0 Ct 4.4.4.3 结果描 述及 判定 4.4.4.3.1 阴性判 定 Ct 4.4.4.3.2 阳性判 定 Ct 30 4.4.4.3.3 可疑判 定 30 Ct 38 Ct 38 _
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