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ICS 65.020.20 CCS B 05 DB5117 四川省（达州市）地方标准 DB5117/T 302020 达州黄花 组织培养 繁育技术 规程 Technical Regulation Of Tissue Culture And Propagation For HemerocalliscitrinaBaroniOf DaZhou 2020-12-17 发布 2020-12-17 实施 达 州 市 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB5117/T 30-2020 前 言 本文件 按照 GB/T 1.1-2020 标准 化工 作导 则 第 1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由达 州市 农业 农村 局 提出 并归 口。本文件 起草 单位：达 州市 农业科 学研 究院。本文件 主要 起草 人：李益、胡振 兴、杨小 丽、高龙 梅、吴 明阳、张 玲、刘小 英、贾 荟芹、李 薇、邓力、杨 峰。DB5117/T 30-2020 引 言 本文件 第4.2.2章节 MS 培 养基配 制，由于 日 常购买 的白砂 糖和琼 脂质 量 存在 差异，在 规定 浓度 范围内自行 选 择用 量 不 影响 最终结 果。本文件 第4.3 章节 不同 培 养阶段 培养基 配制，在 愈 伤诱导 培养基、继 代培养 基、分 化培养 基和 生根培养 基 中 加入70mg/L 的 抗菌剂，可减少 杂 菌污 染 的情况。生根 培养 基中加入2g/L 的活 性炭，可减少培养过程 中褐 化的 现象。本文件第4.10.2 章节 继代 培养，需 控制 愈 伤 组织大小，将 直 径大 于2cm的 愈伤 组 织 切 成 直径2cm大小进行 继 代增 殖。本文件 第5 章节 炼苗，营 养钵 中 基质 成分 及比 例为 泥炭土：珍 珠岩：蛭石=1:1:1。DB5117/T 30-2020 达 州黄花 组织培养 繁育技 术规程 1 范围 本文件 规定 了黄 花组 织培 养繁育 技术 规程 的术 语和 定义、组织 培养 繁育 技术 流程、炼苗 的要 求。本文件 适用 于达 州 市 行政 区域 内 黄花 的组 织培 养育 苗。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 603 化学 试剂 试验 方法中 所用 制剂 及制 品的 制备 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 LY/T 1882 林 木组 织培 养 育苗技 术规 程 3 术语和 定义 LY/T 1882 界定 的以 及 下 列 术语和 定义 适用 于本 文件。3.1 组织培 养 tissue culture 在无菌 培养 基上，对 植物 离体器 官、组织 或细 胞进 行培养，以 形成 再生 植株，或培 养新 的育 种材料的生 物技 术。3.2 外植体 explant 生长在 培养 基上 的被 培养 的器官、组 织或 细胞。3.3 培养基 culture medium 为外植 体的 生长、发 育提 供所需 物质 的基 质。3.4 组培苗 tissue culture seedling 利用 外 植体，在 无菌 和适 宜的人 工条 件下，采 用植 物组织 培养 技术，培 育出 的完整 植株。3.5 接种 inoculation 将外植 体经 消毒 后，在无 菌条件 下植 入培 养基 上的 过程。DB5117/T 30-2020 3.6 褐化 browning 在植物 组织 培养 中，外植 体由于 自身 分泌 的酚 类化 合物被 氧化 产生 褐色 醌类 物质，导致 外植 体褐变的现 象。4 黄花组 织培 养繁 育技 术流 程 4.1 实验室 要求 黄花组 织培 养实 验室 应包 括：药品 室、洗涤 室、准 备 室、缓冲 室、接种 室、培 养 室，配备 完善 的水、电供应 系统 和空 气、灯光、温度、湿 度调 节系 统。4.2 培养基 配制 4.2.1 母 液配 制 按GB/T 603、GB/T 6682 的 规定执行。将 培养 基所需 的大量 元素、铁盐、有机 成分配 制成比 使用 浓度高100 倍的 母液，微量 元 素配制 成比使 用浓 度高1000 倍的母 液，均用棕 色玻 璃 瓶 保存，贴上 标签，注明母液 号、配制 倍数、日 期，保 存在 冰箱 冷藏 室中。4.2.2 MS 培养 基配 制 按GB/T 603、GB/T 6682 的 规定执行。配制MS 培养基 时将四 种母液 按比 例混合 后，加 入白砂 糖、琼脂和水。所 需白 砂糖 浓度 为20g/L 30g/L，琼 脂粉 浓度为4g/L 6g/L。4.3 不同培 养阶 段培 养基 配制 4.3.1 愈伤诱 导培 养基 MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L 4.3.2 继代培 养基 MS+BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L 4.3.3 分化培 养基 MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L 4.3.4 生根培 养基 MS+NAA 0.1mg/L 4.4 培养 基pH 调节 黄花培 养基 最佳pH值为5.73 5.75。用酸 度计 测定pH，并用 1mol/LKOH 或 1mol/L HCl 调节。4.5 培养基 分装 和灭 菌 4.5.1 培养基 分装 配制好 的培 养基 趁热 分装，培 养基 厚度1.5cm 2.5cm。分装 后立 即加 盖或 用封 口膜封 严，不 同的 处理做好 标记。DB5117/T 30-2020 4.5.2 培养基 灭菌 分装后 的培 养基 进行 高压 灭菌处 理，在0.8kPa 1.1kPa、121 状 态下 保持20min。灭菌 完毕 后放 入接种室 冷却 待用。4.6 培养室 消毒 将培养 室清扫 干净，关闭 门窗，按每立 方米 空间用 高锰酸 钾16g，福尔 马林32ml，水16ml，放在 瓷瓦器皿 中混 合产 生蒸 气进 行消毒，消 毒时 间10 12h。每隔15 20d 消毒 一次。4.7 材料选 取 选择春 苗生长 期健 壮无病 斑的黄 花幼苗 整株，切除 根、叶 部分，保留 约8cm 10cm茎 基段，用软 毛刷刷掉 泥土 后再 用水 冲洗30min。4.8 材料消 毒 在无菌 操作 台上 先用75%酒 精浸泡30s，无 菌水 冲洗3 次。再 用0.1%次 氯酸 钠浸 泡58min,用 无菌 水冲洗3 次，冲洗 过程 中不 断 摇晃放 置材 料的 容器，去 除消毒 液残 留。4.9 剥离外 植体 和接 种 在超净 工作台 上铺 上无菌 滤纸，用无菌 镊子 将茎基 段剥开 直至露 出茎 尖生长 点，在20X 的 显微 镜 下用无菌 解剖针 切取0.5mm 茎尖12 个，随 即接 种于黄 花愈伤 诱导培 养基 上，切 口与培 养基表 面接 触。每剥一个 茎段 换一 张无 菌滤 纸。4.10 组培苗 培养 4.10.1 愈伤诱 导培 养 将接种 外植体 的愈 伤诱导 培养基 放置在 培养 架上进 行愈伤 诱导培 养。温度 22 25，光 照强 度800lx，光 照时 间10h/d。4.10.2 继代培 养 长出愈 伤组织 后，转接于 继代培 养基上 进行 增殖培 养，每2-3周 继代一 次。温 度22 25，光 照强度1500lx 2000lx，光 照时间10h/d。4.10.3 分化培 养 选择致密型愈伤组织转接于分化培养基上进行不定芽的分化培养。温度22 25，光 照 强 度1500lx 2000lx，光 照时 间10h/d。4.10.4 生根培 养 将分化 出不 定芽 丛的 愈伤 组织转 接于 生根 培养 基中 进行生 根培 养，每瓶 放3 5 株。温度22 25，光照强 度2000lx 2500lx，光照 时间12h/d。5 炼苗 当组培 苗长 出3 4条 幼根，根系 长度 达到5cm 6cm 时可开 始炼 苗。将培 养瓶 转移到 大棚 苗床 上 开 盖放置3 5d，用 镊子 取出 小 苗，洗 去根 部培 养基，移 栽到装 有基 质的 营养 钵中 生长30 45d，炼苗 时大 棚温度控 制在15 25，湿度保 持在45%60%。DB5117/T 30-2020 _
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