羊快疫、肠毒血症、猝狙防制技术规程DB15／T 98—2020.pdf

ICS 11.220 B 41 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB 15T 982020 代替 DB15/T 98-1993 羊快疫、肠毒血症、猝狙防 制技术规 程 Prevention technical specifications for Braxy,enterotoxemia,struck 2020-07-30 发布 2020-08-30 实施 内 蒙 古 自 治 区 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB 15/T 982020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准代替了 DB15/T 98-1993羊快疫、肠毒血症、猝狙防制技术规程，与 DB15/T 98-1993 相比，除编辑性修改外主要技术变化如下：修改了诊断技术及防制措施（见 2，1993版的 2）；删除了扑灭标准及消灭标准（见 1993 版的 4）。本标准由内蒙古自治区农牧厅归口。本标准起草单位：内蒙古自治区动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：郭宇、马立峰、萨茹拉、申捷、张伶俐、贾皓、苏胜杰、云涛、戴晓光、王永杰、特木尔巴根、武娅楠、赵心力。本标准的历次版本发布情况为：DB15/T 981993。DB 15/T 982020 1 羊 快疫、肠毒血症、猝狙 防制技术 规程 1 范围 本标准规定了羊快疫、肠毒血症、猝狙的诊断技术、预防措施、疫病控制措施和标准。本标准适用于内蒙古自治区境内饲养、经营、运输、屠宰、加工羊只的单位和个人。2 规范性 引用 文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 3073 家畜魏氏梭菌病诊断技术 3 诊断技 术 3.1 羊快疫 3.1.1 流行特 点 羊快疫是由腐败梭菌引起，以真胃黏膜出血性、坏死性炎症为特征的羊的一种急性传染病。营养中等、618月龄的绵羊最易感。山羊也有发生。有低洼草地、熟耕地及沼泽地放牧史。3.1.2 临诊诊 断 病羊多无临床症状，突然死亡。病程稍缓者，表现为不愿行走，运动失调，腹痛，腹泻，磨牙抽搐，最后衰弱昏迷，口流带血泡沫，多于数小时内死亡。3.1.3 病理变化 尸体迅速腐败膨胀，可见黏膜充血呈暗紫色；真胃及十二指肠黏膜有明显的充血、出血；黏膜下组织水肿甚至形成溃疡；胸腔、腹腔、心包有大量积液，暴露于空气易于凝固；心内膜、心外膜有点状出血；肝脏肿大、质脆，呈煮熟状；胆囊胀大，充满胆汁。3.1.4 实验室 诊断 3.1.4.1 涂片、镜检 用清洁玻片在病死畜肝被膜进行组织触片，瑞氏染色镜检，除见有单在或短链的粗大杆菌外，还可见无关节的长丝状菌体；用革兰氏染色镜检，可发现大量革兰氏阳性典型丝状菌体。3.1.4.2 分离培 养和 鉴定 采集病死羊肝脏及肠内容物，无菌接种到葡萄糖鲜血琼脂平板上，37 厌氧培养 24 h，形成微隆起的、边缘厚薄不均的淡灰色菌落，菌落周围有微弱的溶血区。挑取单个菌落进行纯培养，并将纯培养DB 15/T 982020 2 物接种于厌氧肉肝汤中，37 厌氧培养24 h后，肉汤均匀混浊，且有白色絮片状沉淀存在于管底，并产生腐败味气体。挑取纯培养物进行生化实验，该菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、水杨素、乳糖，不发酵蔗糖。3.1.4.3 动物 试验 取患病动物的血液或者病料制成的乳剂肌肉注射于小白鼠，24 h后死亡。迅速采取死亡小白鼠的肝脏涂片、染色、镜检，可见两端钝圆的粗大杆菌外，还可见无关节的长丝状菌体。3.2 羊肠毒 血症 3.2.1 流行特 点 羊肠毒血症是由D型产气荚膜梭菌在羊肠道中大量繁殖产生毒素所引起，以腹泻、惊厥、麻痹和突然死亡、死后肾组织软化为特征的一种急性传染病。各种品种、年龄的羊都可感染发病，多呈散发，绵羊较山羊多发。2 月12月龄且膘情较好的羊最易发病。在牧区，多发于春夏之交、抢青时和秋季牧草结籽后；在农区，多发于收割抢茬季节或采食了大量谷类之后，流行具有明显的地方性。3.2.2 临诊诊断 3.2.2.1 抽搦型 突然发作。倒毙前，四肢出现强烈的划动，肌肉颤搐，眼球转动，磨牙，口水过多，随后头颈显 著抽缩，常于 2 h4 h内死亡。3.2.2.2 昏迷沉 睡型 早期为步态不稳，以后卧倒，并有感觉过敏、流涎，上下颌“咯咯”作响，继而昏迷，角膜反射 消失，有的病羊发生腹泻，常在 3 h4 h内安静地死去。3.2.3 病理变化 肠道（尤其小肠）黏膜充血、出血，重症病例整个肠壁呈血红色，有时出现溃疡；心包常扩大，内含灰黄色液体和纤维素絮块，左心室的心内外膜下有点状出血；肺脏出血和水肿；胸腺出血；死后肾脏软化如泥样。全身淋巴结肿大、出血。3.2.4 实验室 诊断 3.2.4.1 涂片、镜检 用清洁玻片在病死畜肠道病变部位黏膜、肾脏或淋巴结进行组织触片，革兰氏染色镜检，可发现大量革兰氏阳性、两端钝圆、边缘整齐有荚膜、单个或成双排列、偶见有芽孢的大杆菌。3.2.4.2 分离培 养和 鉴定 将采集的病死畜心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、空肠肠壁病料，无菌接种到血琼脂培养基，43 厌氧培养 24 h，培养皿中可见 2.0 mm3.0 mm表面光滑、半透明双溶血菌落。将可疑菌落接种于肉汤进行增殖培养后接种于含铁牛乳培养基，在 46 水浴中培养 2 h出现典型的“暴烈发酵”现象。3.2.4.3 毒素检 查和 中和 试验 DB 15/T 982020 3 取回肠内容物，经离心沉淀后取上清液分成两份，一份不加热，一份60 30 min处理，分别给小鼠静脉注射0.1 mL0.3 mL，若加热组小鼠不死亡，而不加热组小鼠死亡即证明有毒素存在。然后进一步进行毒素中和保护试验，可检测到D 型产气荚膜梭菌毒素。3.2.4.4 产气 荚膜 梭菌 毒素 基因 的 PCR 检测 3.2.4.4.1 器材 厌氧培养箱、生物安全柜、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、恒温水浴锅、振荡器、离心机、高压灭菌锅。3.2.4.4.2 培养基 和试 剂 血琼脂平板、增菌培养基、Taq酶、DNA模板、dNTPs 水、双蒸水。3.2.4.4.3 DNA 模 板的 制备 3.2.4.4.3.1 组织样 品制备 取约0.2 g的待检组织样品于灭菌干燥的研钵中充分研磨，加 1 mL PBS（含青霉素或链霉素）混匀 3000 r/min离心5 min取上清，转入无菌的1.5 mL 离心管中，样本在2 8 条件下保存，应不超过24 h。若需长期保存，应放在-70 以下冰箱，但应避免反复冻融。3.2.4.4.3.2 增菌培 养物 制备 将分离鉴定的产气荚膜梭菌接种于肉汤培养基中，43 厌氧培养12 h。3.2.4.4.3.3 试剂盒 法 取处理好的增菌培养物或组织样品，使用商品化的 DNA 提取试剂盒提取 DNA 做为模板，DNA 模板可置于-20 保存备用。3.2.4.4.4 PCR 反 应体 系 PCR反应体系见表 1。表 1 PCR 反应 体系（总体 积 为 25 L）PCR反应管中依次加入上述成分，充分混匀后，瞬时离心，确保所有反应成分混匀并集于管底。10Taq buffer(含 Mg2+)2.5 L dNTPs 2.5 L 上游和下游引物(10 pmol/L)各 1 L 模板 2 L 无菌双蒸水 15.75 L Taq DNA 聚合酶 0.25 L DB 15/T 982020 4 3.2.4.4.5 PCR 对照 设立阳性对照、阴性对照和空白对照，用 D型、C型产气荚膜梭菌标准菌株的菌体做阳性对照，用大肠杆菌标准菌株的菌体做阴性对照，用无菌双蒸水做空白对照。3.2.4.4.6 PCR 扩 增程 序 将上述加有 DNA 模板的 PCR 管，置于 PCR 仪内进行反应。反应条件如下：94 变性 5 min，然后进行 30 个循环的扩增（94 变性 30 s；53 退火30 s；72 延伸 1 min），最后 72 延伸 10 min，4 保存。3.2.4.4.7 电泳 用TAE(配制方法见附录 A)制备1%琼脂糖凝胶，加样 6 L8 L，在电压80 V-100 V、电流 40 mA下进行电泳 30 min40 min。3.2.4.4.8 结果判 定 3.2.4.4.8.1 试验成 立的 条件 当阴性对照和空白对照不出现条带、阳性对照出现清晰条带，试验成立。（参照附录 B 进行判定)3.2.4.4.8.2 判定 D型产气荚膜梭菌：电泳同时出现 a325bp、656bp 共2条带。C型产气荚膜梭菌：电泳同时出现 a325bp、196bp 共2条带。3.3 羊猝狙 3.3.1 流行特 点 羊猝狙是由C型产气荚膜梭菌毒素所引起，以溃疡性肠炎和腹膜炎为特征的羊的一种急性传染病。成年绵羊，尤其 12 岁者多发。山羊也有发生。常见于低洼、沼泽地区。多发生于冬、春季节。主要经消化道感染，常呈地方流行性。3.3.2 临 诊诊 断 病程短促，常未及见到症状即突然死亡。有时发现病羊掉群、卧地，表现不安、衰弱、痉挛、眼球突出，在数小时内死亡。3.3.3 病理变化 十二指肠和空肠黏膜严重充血、糜烂，有的区段可见大小不等的溃疡；胸腔、腹腔和心包大量积液，后者暴露于空气后，可形成纤维素絮块；病羊刚死时骨骼肌表现正常，但在死后 8h 内，肌间隔积聚血样液体，肌肉出血，有气性裂孔。3.3.4 实验室 诊断 3.3.4.1 涂片、镜检 具体方法同3.2.4.1。3.3.4.2 分离培养和鉴定 具体方法同 3.2.4.2。DB 15/T 982020 5 3.3.4.3 用小肠内容物滤液接种小鼠进行毒素检查和中和试验(具体方法同3.2.4.3)，可检测到C型产气荚膜梭菌毒素。3.3.4.4 产气荚膜梭菌毒素基因的PCR 检测 具体方法同 3.2.4.4。4 预防措施 4.1 加强饲养管理，科学进行饲喂。不饲喂来源于低洼草地、熟耕地及沼泽地等易被梭菌及其毒素污染的饲草和饮水；牧区夏初发病时，应少抢青，多在青草萌发较迟的地方放牧，秋末宜到草黄较迟的地方放牧；在农区减少抢茬，少喂菜根菜叶等多汁饲料。4.2 在本病常发地，每年定期注射“羊快疫-肠毒血症-猝狙三联苗”，或“羊快疫-肠毒血症-猝狙-羔羊痢疾-黑疫五联苗”。5 疫病控 制 措 施和 标准 5.1 疫病控 制措 施 5.1.1 羊快疫、肠毒血症、猝狙发生、流行时，可立即转群，牧区要转移到高燥的地区放牧。同群羊只及周围羊群应做好紧急预防注射。5.1.2 发病时，应将病羊及时隔离，对病程较长的病羊用青霉素、磺胺嘧啶等抗菌药物进行治疗。5.1.3 被污染的场地、棚圈、卧盘和用具可用卤素类、碱类或酚类等消毒药进行消毒，病畜不得屠宰剥皮和吃肉。5.2 疫病控制 标准 连续两年内羊快疫、肠毒血症、猝狙发病率不超过全年饲养量的0.05%，即达到控制。DB 15/T 982020 6 A A 附 录 A（规范 性附 录）PCR 反 应溶 液的 配制 50 TAE 电泳缓冲储存液 三羟甲基氨基甲烷（Tris 碱）乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）双蒸水 242 g 37.2 g 800 mL TAE电泳缓冲液（pH 约8.5）的配制要求如下：待上述混合物完全溶解后，加入 57.1 mL的醋酸充分搅拌溶解，加双蒸水至 1 L后，置室温保存。应用前，用无菌双蒸水将 50 TAE 电泳缓冲液 50 倍稀释。DB 15/T 982020 7 B B 附 录 B（资料 性附 录）PCR 检 测鉴 定结 果 B.1 PCR引物序列见表B.1。具体参照NY/T3073 进行诊断。表B.1 PCR 引 物序 列 基因 bp 上游引物(5七 3)下游引物(5-3)(alpha)cpa(325)GCTAATGTTACTGCCGTTGA CCTCTGATACATCGTGTAAG(beta)cpb(196)GCGAATATGCTGAATCATCTA GCAGGAACATTAGTATATCTTC(epsilon)etx(656)GCGGTGATATCCATCTATTC CCACTTACTTGTCCTACTAAC(iota)iap(446)ACTACTCTCAGACAAGACAG CTTTCCTTCTATTACTATACG B.2 毒素基因PCR检测结果见图B.1。具体参照NY/T 3073 进行诊断。说明：M 一2000 Marker 1 A型标准株 NCTC 528（）2-分离株 1;3-分离株 2；4-分离株 3；5-分离株 4 6-空白对照；7-阴性对照；8-A型阳性对照（）9-C 型阳性对照（、）图B.1 毒素基 因 PCR 检 测结 果 _