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ICS 65.0 20.20 B 05 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 21712020 甘蔗品种真实性鉴定 SSR 分子标记法 SSR-based methods for variety genuineness testing of sugarcane 2020-10-29 发布 2020-11-30 实施广西壮族自治区市场监督管理局 发布 D B4 5/T 21 712 02 0 I 前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 20标准化工作导则 第1部分：标 准化文件的 结构和起草 规则的规 定 起草。本文件由广西壮族自治区分析测试研究中心提出并宣贯。本文件由广西糖业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：广西益谱检测技术有限公司、广西博测检测技术服务有限公司、广西吉锐安全技 术有限公司、广西壮族自治区分析测试研究中心。本文件主要起草人：梁俊、刘守廷、黄易勤、苏丽梅、杜寒春、黄小娟、刘巧频、何慧、梁群清、莫璋红、韦秋翠、韦秀兰。D B4 5/T 21 712 02 0 1 甘蔗品种真实性鉴定 SSR 分子标记法 1 范围 本文件规定 了利用简单 重复序列（SSR）标记进行甘蔗品种 真实性鉴定 的操作程序、数据记录 与统 计、判定方法。本文件适用于甘蔗品种S SR指纹数据 采集及品种真实性鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。GB/T 6 68 2 分析实验室用水规格和试验方法 GB 1 94 89 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 推荐引物 reco mm e n ded p ri mer 品种鉴定中 优先选用一 套简单重复 序列（SSR）引物，其检 测位点具有 多态性高、重复性好等 综合 特性。3.2 对照品种 co nt ro l va riety 对照品种具 有所用SSR位 点上不同等 位变异的特 性。对照品 种用于辅助 确定待测样 品的等位变 异，校正仪器设备的系统误差。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。SS R：简单重 复序列（Si m pl e se qu en c e re pe at s）；PC R：聚合酶 链式反应（P ol yme ra se C hai n Re ac ti on）；DN A：脱氧核 糖核酸（De ox y ri bo n uc lei c ac i d）。5 原理 依据甘蔗品种基因组中S SR的重复次 数存在差异，通过PC R扩增 及电泳技术可以鉴定甘蔗品种。DB 45/T 2 17 1 20 20 2 6 材料和试剂 除另 有 说明外，本文件中 使 用分析 纯（含）以 上试 剂，用 水 符 合GB/T 6 68 2规定的 二级 水，其中P CR 用水要求 达到 一 级 水指标。6.1 试剂 6.1.1 三羟甲基氨基甲烷（C 4 H 11 NO 3）：纯度 99%。6.1.2 乙二胺四乙酸二钠(E D T A 2 N a)：纯度 99.0%。6.1.3 硼酸（H 3 B O 3）：=1.4 3 g/c m，含量 99.5%。6.1.4 十六烷基三甲基溴 化 铵（CT A B）：=1.3 2 g/m L，纯度 99.0%。6.1.5 氯 化 钠（N a C l）：=2.16 5 g/c m，含量 99.5%。6.1.6 琼脂 糖。6.1.7 过 硫酸铵（(N H 4)2 S 2 O 8）：=1.98 g/c m，含量 9 8.0%。6.1.8 氢氧 化 钠(N a OH）：=2.1 3 g/c m，含量 96.0%。6.1.9 硝酸银（A gNO 3）：=4.35 g/c m，含量 98.0%。6.1.10 甲醛（H C HO）：=0.81 5 g/c m。6.1.11 液氮（N 2）：=0.81 g/c m。6.1.12 三氯甲烷（C H Cl 3）：=1.5 0 g/c m。6.1.13 无 水 乙醇（C H 3 C H 2 OH）：=0.7 9 g/c m，含量 99.7%。6.1.14 DN A 分析仪 用 LI Z 5 00 分 子量 内标。6.1.15 去离子甲酰胺（C H 3 NO）：=1.1 33 g/m L。6.1.16 40%丙烯酰胺/甲叉双丙烯 酰胺溶液（A cr y l/Bi s S o lu ti o n(29:1)）。6.1.17 四甲基乙二胺（T EM ED）：=1.3 2 g/m L。6.1.18 DN A 分 子量 标准（DN A ma r k e r）：可 以 清 楚 区分 5 0 b p 5 00 b p的 DN A 片段。6.1.19 2 Ta q Pl us PC R 预混 试 剂：0.1 U/L T aq P lu s P o l y me ra se、5 00 M dN TP e ac h、2 0 m M Tr is-H Cl(p H=8.3)、1 00 m M K Cl、3 m M Mg Cl 2、稳 定 剂、增强剂。6.2 溶液配制 6.2.1 5 TBE 缓冲液 称取5.4 g三 羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、0.37 2 g 乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）和2.75 g硼 酸（6.1.3）溶 于 7 0 m L纯 水中，定容 至 10 0 m L，在 10 3.4 k P a（12 1）条件 下 灭菌 20 m in。6.2.2 0.5 TBE 缓冲液 量取 10 0 m L浓 度5 TB E缓冲 液（6.2.1）于 烧杯 中，加入 90 0 m L纯 水 混匀。6.2.3 C TA B 提取溶液 称取 4 g十六 烷基三甲基溴 化 铵（6.1.4）、16.3 8 g氯 化 钠（6.1.5）、1.21 g三羟 甲基氨基甲烷（6.1.1）、1.49 g乙二胺 四乙酸二钠（6.1.2）溶 于 7 0 m L纯 水，定容 至 2 00 m L，在 10 3.4 k Pa（12 1）条件下 灭菌20 mi n。6.2.4 无菌纯水 纯 水 在 10 3.4 k P a（1 21）条件下 灭菌 20 mi n。D B4 5/T 21 712 02 0 3 6.2.5 1%琼脂糖溶液 1 g琼脂糖（6.1.6）溶于10 0 mL 的0.5 TB E缓冲液（6.2.2），适 当加热融化。6.2.6 1 0%过硫酸铵溶液 称取10 g过硫酸 铵（6.1.7），加入10 0 mL纯水溶解。6.2.7 电泳缓冲液 称取10 8 g三 羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、7.4 4 g乙 二胺四乙酸二钠（6.1.2）、55 g硼酸（6.1.3）、0.8 g氢氧化 钠（6.1.8），加入10 L纯 水溶解。6.2.8 染色液 称取0.2 g硝 酸银（6.1.9），加入40 0 mL纯水溶解。6.2.9 显色液 称取4 g氢氧 化钠（6.1.8），加入40 0 mL纯水溶解，临用时再加1.6 m L甲醛（6.1.10）。7 仪器和设备 7.1 电子天平：精确至 0.1 m g。7.2 恒温水浴锅。7.3 高速冷冻离心机：最高 1 5 00 0 rpm。7.4 PC R 扩增仪。7.5 垂直板电泳系统。7.6 凝胶成像系统。7.7 毛细管电泳仪。8 S SR 引物序列信息 引物序列信息见附录A。9 操作步骤 9.1 样品采集 采集或送检的甘蔗青叶片做好标识，于-18 冰 箱中保存备用。9.2 D NA 的提取 取9.1中适量 甘蔗叶片用自 来水冲洗 干净，再用 纯水冲洗两 遍，自然晾 干后用不锈 钢剪刀剪碎 放入 研钵中，加入液氮（6.1.1 1）研 磨成 粉末状，分取10 0 mg放入 1.5 mL离心管 中，加入75 0 L C T A B提取溶液（6.2.3），涡旋振荡混匀后于65 水浴45 min 60 m in，期 间每隔15 m i n 颠倒离心 管混匀；加入500 L的三氯甲 烷（6.1.12），颠倒混匀，12 00 0 rpm 离心 3 m in，转移上清液约0.5 m L至 新离心管中，加入 等体积（0.5 m L）约 4 的无水乙醇（6.1.1 3），颠倒混匀，于-18 冰 箱中静置1 h，12 00 0 rpm 离 心 3 m in，去上 清，室温下干燥至乙醇挥发完全；加入50 L无 菌纯水（6.2.4）于 4 条件 下 保存备用。DB 45/T 2 17 1 20 20 4 注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本文件。9.3 P CR 扩增 9.3.1 P CR 反应体系 PC R 反 应 体 系 见表 1。表1 P CR 反应体系 试剂 终浓度 体积 无菌纯水-8.5 L 2 Taq Plus PCR 预混试剂 1 12.5 L 10 mol/L 正向引物 0.4 mol/L 1.0 L 10 mol/L 反向引物 0.4 mol/L 1.0 L 25 ng/L DNA 模板 2.0 mol/L 2.0 L 总体积 25.0 L 9.3.2 P CR 反应程序 94 预 变性2 m i n；9 4 变性 3 0 s，退火 3 0 s（退火 温度见附 录 A推荐 引物 表），7 2 延 伸3 0 s，35 个循环；最 后7 2 下 延伸 2 m in。9.4 P CR 产物检测 9.4.1 毛细管电泳检测 9.4.1.1 P CR 产物样品准备 分 别取 等 体积 的 稀释后 不同引物（附 录 A）P C R 扩增产 物 溶液混 合，从混 合 液 中 吸取 1 L 按序 号加 入到DN A 分析仪 专 用96 孔板 孔 中，板 中 各孔 分 别再加入 0.1 L DN A 分析仪用 LI Z 5 00分 子量 内标(6.1.1 4)和 8.9 L去离子 甲酰胺（6.1.1 5）。将 样品 在 PC R仪上 9 5 变性 5 m i n，取 出，迅速 置 于 碎冰块 上，冷却 10 mi n 1 5 mi n。将整个 96 孔板置 于 离 心 机 中，离 心10 s 后放置 到DN A 分析仪 上待检。9.4.1.2 电泳检测 按照仪器操作规程，编辑 样品 表 及 运 行程序，执 行 运 行程序，仪器自 动给 出检测结 果，保存 并记录 数据。9.4.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 9.4.2.1 聚丙烯酰胺凝胶制备 在 一对 玻璃 板间插入 1.0 mm 宽 的 间隔片，在封 口 处 注 入 1%琼脂 糖 溶液（6.2.5），让 其 凝固密封。在5 0 m L量杯 中 依次加入7.5 m L 5 TB E 缓冲液（6.2.1）、7.5 m L 40%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液(29:1)（6.1.16），搅拌 并用 纯 水定容 至3 0 m L；加入 200 L 1 0%过 硫 酸铵溶液（6.2.6）和 12 L四甲基乙二胺（6.1.1 7），混匀后倒入凝胶板之间，随即插 好样品 梳，使 其 在5 0 mi n 60 m in内聚 合 凝固，凝胶 高 度 应不小于10 cm。D B4 5/T 21 712 02 0 5 9.4.2.2 电泳 将玻璃板固 定于垂直电 泳槽上，在 电泳槽中加 入电泳缓冲 液（6.2.7），小心拔下样 品 梳。用 加样 器 吸取1 L 不同引物（附 录 A）PCR 产 物，加入 样品孔 中，同时在同一 块胶中 加入1 L DN A 分 子量标准（6.1.18）。电泳选用的电压梯度为1 V/c m 5 V/cm，2 Taq P lu s P CR 预混 试剂（6.1.1 9）的 蓝色 指 示 带到达胶板2/3处（大约 1 h）后，可结 束电泳。9.4.2.3 银染显色 将附着凝胶的玻璃板用纯水冲洗30 s 60 s后，将 凝胶放入方形不锈钢盘中，加入染色液（6.2.8）覆盖凝胶，轻摇5 m i n 1 0 m in进行 染色；倒掉染色液，用纯水快速漂洗，放入显色液（6.2.9）中，轻 摇至显色出清晰带纹；取出凝胶用纯水冲洗两遍，沥干后进行拍照。1 0 数据记录与统计 10.1 样品每个 SS R 位点等位变 异采用扩增片段长度表示；对 于 毛细管电泳检测方法，使用对照品种消 除D N A分析 仪间可能存在的系统误差，使用片段分析软件读取位点等位变异。10.2 对于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法，将待检样品与对照品种的等位变异片段进行比较，明 确待检样品位点等位变异。10.3 纯合位点结合等位变异大小数据记为X/X，其 中 X为 该位 点等位变异的大小；杂合位点的等位变 异大小数据记录为X/Y，其 中 X、Y 分 别为该位点上的 2 个等 位变异的大小，小片段数据在前、大片段 数据在后；缺失位点的等位变异大小数据记录为 0/0。示例1：样品在某个位点上仅出现 1 个等位变异，大小为 160 bp，则该位点的等位变异数据记录为 160/160。示例2：样品在某个位点上仅出现 2 个等位变异，大小为 160 bp、165 bp，则该位点 的等位变异数据记录为 160/165。1 1 判定方法 11.1 当待检样品和对照品种间差异位点数2，则判 定为“不同品种”。11.2 当待检样品和对照品种间差异位点数=1，判定 为“近似品种”。11.3 当样品间差异位点数=0，判定为“极近似品种或相同品种”。DB 45/T 2 17 1 20 20 6 附 录 A（规范性）推荐引物 推荐 引物 见表A.1。表 A.1 引物编号及引物扩增信息 序号 引物名称 条带大小（bp）引物退火温度（）引物序列 1 SMC7CUQ 158-171 60 正向：5-GCCAAAGCAAGGGTCACTAGA-3 反向：5-AGCTCTATCAGTTGAAACCGA-3 2 mSSCIR36 100-180 54 正向：5-CAACAATAACTTAACTGGTA-3 反向：5-CTGTCCTTTTTATTCTCTTT-3 3 SMC1825 60-120 56 正向：5-CACGTCCTTCCGCCTTGA-3 反向：5-TCATCGTTCGTCGCACTG-3 4 SMC24DUQ 121-142 64 正向：5-CGCAACGACATATACACTTCGG-3 反向：5-CGACATCACGGAGCAATCAGT-3 5 SMC31CUQ 138-185 62 正向：5-CATGCCAACTTCCAATACAGACT-3 反向：5-AGTGCCAATCCATCTCAGAGA-3 6 SMC36BUQ 104-254 64 正向：5-GGGTTTCATCTCTAGCCTACC-3 反向：5-TCAGTAGCAGAGTCAGACGCTT-3 7 SMC119CG 105-131 58 正向：5-TTCATCTCTAGCCTACCCCAA-3 反向：5-AGCAGCCATTTACCCAGGA-3 8 SMC278CS 140-182 64 正向：5-TTCTAGTGCCAATCCATCTCAGA-3 反向：5-CATGCCAACTTCCAAACAGACT-3 9 SMC334BS 132-165 60 正向：5-CAATTCTGACCGTGCAAAGAT-3 反向：5-CGATGAGCTTGATTGCGAATG-3 10 SMC336BS 141-185 62 正向：5-ATTCTAGTGCCAATCCATCTCA-3 反向：5-CATGCCAACTTCCAAACAGAC-3 11 SMC486CG 224-245 58 正向：5-GAAATTGCCTCCCAGGATTA-3 反向：5-CCAACTTGAGAATTGAGATTCG-3 12 SMC569CS 165-233 62 正向：5-GCGATGGTTCCTATGCAACTT-3 反向：5-TTCGTGGCTGAGATTCACACTA-3 13 SMC597CS 144-179 64 正向：5-GCACACCACTCGAATAACGGAT-3 反向：5-AGTATATCGTCCCTGGCATTCA-3 14 SMC703BS 203-229 62 正向：5-GCCTTTCTCCAAACCAATTAGT-3 反向：5-GTTGTTTATGGAATGGTGAGGA-3 15 SMC851MS 127-152 58 正向：5-ACTAAAATGGCAAGGGTGGT-3 反向：5-CGTGAGCCCACATATCATGC-3 16 SMC1604SA 92-127 58 正向：5-AGGGAAAAGGTAGCCTTGG-3 反向：5-TTCCAACAGACTTGGGTGG-3 D B4 5/T 21 712 02 0 7 表A.1(续)序号 引物名称 条带大小（bp）引物退火温度（）引物序列 17 SMC1751CL 134-154 60 正向：5-GCCATGCCCATGCTAAAGAT-3 反向：5-ACGTTGGTCCCGGAACCG-3 18 mSSCIR3 160-190 60 正向：5-ATAGCTCCCACACCAAATGC-3 反向：5-GGACTACTCCACAATGATGC-3 19 mSSCIR43 168-252 52 正向：5-ATTCAACGATTTTCACGAG-3 反向：5-AACCTAGCAATTTACAAGAG-3 20 mSSCIR66 122-146 48 正向：5-AGGTGATTTAGCAGCATA-3 反向：5-CACAAATAAACCCAATGA-3 21 mSSCIR64 217-300 54 正向：5-ATTGGATTCCTTCTGCTA-3 反向：5-CATCACAACAGGTTTCAG-3 22 SMC1237 90-160 58 正向：5-TTCACGAACACCCCACCTA-3 反向：5-GCGCCAGGTAACCTACTGAA-3 23 SMC1814 120-190 64 正向：5-GGTTGACGATGAGAAGGACGTG-3 反向：5-CACCCACATAGTGCCCAACG-3 24 SMC286 100-200 58 正向：5-TCAAATGGGACCTTATTGGAG-3 反向：5-TCCCTCGATCTCCGTTGTT-3 25 UGSM10 98-125 58 正向：5-GCTACTATGGACAACAGGG-3 反向：5-ATGAAGAGACGAGACGAAGA-3 26 UGSM97 171-181 52 正向：5-ATAACACACACACACACAAA-3 反向：5-TTCCGAGGGCAAATAATC-3 27 mSSCIR21 100-200 54 正向：5-CGCCAGCCACATAAAAGG-3 反向：5-CGACCAGGAGTTCATCAA-3 28 mSSCIR16 160-240 54 正向：5-TGGGGAGGGCTGACTAGA-3 反向：5-GGCGGTATATATGCTGTG-3 29 mSSCIR26 100-160 54 正向：5-AAAATCAGACAAACAGCAT-3 反向：5-AGAAGAAGCAGATACAGGT-3 30 mSSCIR34 60-120 54 正向：5-ATCGCCTCCACTAAATAAT-3 反向：5-TTGTCTTTGCTTCCTCCTC-3 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 中华人民共和国广西地方标准 甘蔗品种真实性鉴定 SSR 分子标记法 DB 45/T 2171 2020 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究
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