罗氏沼虾双顺反子病毒-1 检测规程DB33／T 2287-2020.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 41 DB33 浙江省 地 方 标 准 DB33/T 2287 2020 罗氏沼虾 双顺反子 病毒-1 检测规程 Detection protocols for Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus-1 2020-11-30 发布 2020-12-30 实施 浙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB33/T 2287 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2020 标准 化工作 导则 第1 部 分：标 准化文 件的 结构和 起草规 则给 出的 规则起草。本标准 由浙 江省 农业 农村 厅提出。本标准 件由 浙江 省水 产标 准化技 术委 员会 归口。本标准 起草 单位：浙 江省 淡水水 产研 究所。本标准 主要 起草 人：潘晓 艺、沈 锦玉、蔺 凌云、姚 嘉赟、尹文 林、曹铮、刘 忆瀚、夏炎 春。DB33/T 2287 2020 II 引 言 本标准 的发布 机构 提请注 意如下 事实，声明 符合本 标准时，可能 涉及 到6.10-6.11中 引物与 罗 氏沼虾双 顺反 子病 毒全 基因 组序列 及其 应用(专利 号：201110296487.9)专利 权 的使用。本标准 的发 布机 构对 于该 专利的 真实 性、有效 性和 范围无 任何 立场。该专利 持有 人已 向本 标准 的发布 机构 保证，他 愿意 同任何 申请 人在 合理 且无 歧视的 条款 和条 件 下，就专利 授权 许可 进行 谈判。该专 利持 有人 的声 明已 在本标 准的 发布 机构 备案。相关 信息 可以 通 过 以 下 联系方式 获得：专利持 有人：浙 江省 淡水 水产研 究所 地址：浙江 省湖 州市 吴兴 区杭长 桥南 路999 号 请注意 除上 述专 利外，本 标准的 某些 内容 仍可 能涉 及专利。本 标准 的发 布机 构不承 担识 别这 些 专 利的责任。DB33/T 2287 2020 1 罗 氏沼虾 双顺反子 病毒-1 检测规程 1 范围 本标准 确立 了罗 氏沼 虾双 顺反子 病毒-1的 检测 程序，规 定了 术语 与定 义、缩 略 语、罗氏 沼虾 双顺 反子病毒-1检测 程 序的 构成、试剂 和材 料、器材 与设 备、操 作步 骤和 结果 判定。本标准 适用 于罗 氏沼 虾双 顺反子 病毒-1的 检测 及关 联疾病 的流 行病 学调 查、诊断和 监测。2 规范性 引用 文件 下 列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 6682-2008 分 析实 验 室用水 规格 和试 验方 法 GB 19489 实验 室 生 物安 全通用 要求 SC/T 7103 水生 动物 产地 检疫采 样技 术规 范 SC/T 7202.1 斑 节对 虾杆 状病毒 病诊 断规 程 第1 部 分：压 片显 微镜 检查 法 3 术语与 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 罗氏沼 虾双 顺反 子病毒-1 Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus-1 罗氏沼 虾幼 体死 亡综 合征 的主要 病毒 性病 原，又称 为 罗氏沼 虾太 湖病 毒（Macrobrachium rosenbergii taihu virus，MrTV），属 于小RNA 病 毒目、双 顺反 子 病毒科、急 麻病 毒属，病 毒粒子 为无 囊膜 的直 径约30 nm的 二十 面体球 形颗 粒，核酸 类型为 单股 正链RNA，长度 约10.3 kb。其主 要 侵染罗 氏沼虾 幼体 甲壳下上皮 组织 和神 经节，造 成肝脏 和结 缔组 织出 现强 嗜碱性 细胞 质包 涵体。4 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件。bp：碱 基对（Base pair）DEPC：焦乙 酸二 乙酯（Diethyl pyrocarbonate）DNA：脱氧 核糖 核酸（Deoxyribonucleic acid）dATP：脱氧 腺苷 三磷 酸（Deoxyadenosine triphosphate）dCTP：脱氧 胞苷 三磷 酸（Deoxycytidine triphosphate）dGTP：脱氧 鸟苷 三磷 酸（Deoxyguanosine triphosphate）dNTP：脱氧 核苷 三磷 酸（Deoxyribonucleoside triphosphate）DB33/T 2287 2020 2 dTTP：脱氧 胸苷 三磷 酸（Deoxythymidine triphosphate）EB：溴 化乙 啶，核酸 染色 剂（Ethidium bromide）MrDV-1:罗 氏沼 虾双 顺反 子病毒-1（Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus-1）MrTV：罗氏 沼虾 太湖 病毒（Macrobrachium rosenbergii taihu virus）M-MLV：莫 洛尼 鼠白 血病 病 毒（Moloney murine leukemia virus）RdRp：RNA 依赖 的RNA 聚合 酶（RNA-dependent RNA polymerase）RNA：核糖 核酸（Ribonucleic acid）RNasin：核 糖核 酸酶 抑制 剂（RNase inhibitor）RT-PCR：逆 转录-聚 合酶 链 式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction）Taq：水生 噬热 杆菌（Thermus aquaticus）5 罗氏沼 虾双 顺反 子病 毒-1 检测程 序的 构成 罗氏沼 虾双 顺反 子病 毒-1 检测程 序包 括5 个阶 段，其中RT-PCR 操作 阶段 又分3 个步 骤。程序 流程 图见图1。图 1 罗氏 沼虾 双顺 反子 病 毒-1检 测程 序流 程图 DB33/T 2287 2020 3 6 试剂和 材料 6.1 水：符 合 GB/T 6682-2008 中一 级水 的要 求，核酸 抽提 和RT-PCR 应使 用无RNA 酶 的去 离子 水。6.2 dNTPs：含dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 10 mmol/L 的混合 物，20 保存。6.3 RNA 酶 抑制 剂：40 U/L，20 保 存，避免 反复 冻 融或温 度剧 烈变 化。6.4 M-MLV 逆转 录酶：200 U/L，20 保存，避 免反 复冻融 或温 度剧 烈变 化。6.5 5 M-MLV 逆转 录酶 缓冲 液：20 保 存。6.6 10 PCR 缓冲 液：20 保存。6.7 Taq DNA 聚 合酶：5 U/L，20 保存，避 免反 复 冻融或 温度 剧烈 变化。6.8 DNA 分 子量 标准：DNA Marker DL2000，20 保 存。6.9 琼脂糖：电 泳级。6.10 RT-PCR 外 引物：MrTV572F1：5-ATGTA-GAGCG-TGGAG-GAGTA-AAA-3，MrTV572R1：5-CACTA-TCTCT-GTCTT-CGAGG-GATT-3，扩增RdRp 基 因的572 bp 片 段。6.11 RT-PCR 内 引物：MrTV472F2：5-TGCTT-CTATT-TCGGC-TCG-3，MrTV472R2：5-CAACG-AATTA-GGGAG-AGG-3，扩增RdRp 基 因的472 bp 片 段。6.12 阳性对 照为 已知 受MrTV 感 染且 RT-PCR 结 果显 示强 阳 性的虾 组织，80 保 存。6.13 阴性对 照为 已知 未 受 MrTV 感染 且RT-PCR 结果 显示 阴 性的虾 组织，80 保 存。6.14 空白对 照为 无RNA 酶 的水。7 器材与 设备 7.1 普通冰 箱。7.2 超低温 冰箱：最 低可 设定 温度86。7.3 组织研 磨器。7.4 生物安 全柜 或超 净工 作台。7.5 低温高 速离 心机：温 度可 设置范 围 0 40，最高可 设定 转速 15 000 转/分 钟。7.6 可控温 水浴 锅或 加热 模块。7.7 微量移 液器。7.8 PCR 仪。7.9 电泳仪。7.10 水平电 泳槽。7.11 紫外透 射仪 或凝 胶成 像仪。7.12 微波炉。8 操作步 骤 8.1 样品的 准备 样品采 集的 要求 和数 量按SC/T 7103 和SC/T 7202.1 的 规定。DB33/T 2287 2020 4 鲜活幼 体、仔虾 及体 长在3 cm 以 下稚 虾个 体样 品约30 mg 50 mg(去 掉稚 虾眼)；成虾 取约30 mg 50 mg 鳃丝 或游 泳足。所取样 品分 别置 于1.5 mL 无RNA 酶微 量离 心管 中，立 即进行RNA 提取 操作 或加 入1 mL TRIzol 试 剂，充分研 磨后，暂 时保 存于 20。8.2 RNA 模板 的提 取 在样品 管中 加入 1 mL TRIzol 试 剂，用研 磨器 研磨，置室 温 5 分钟 后，加入 0.2 mL 氯仿，震 荡混匀 15 秒，室 温放 置 5 分钟。于 4 下，12 000 转/分钟 离心 10 分钟，取上层 水相，移 至一 支无RNA 酶 的离 心管 中。加0.5 mL 异 丙醇，混 匀，置室 温10 分钟。于4 下，12 000 转/分钟 离心10 分钟，尽 弃上 清。加入 20 预冷 的 1 mL 无 RNA 酶 70%乙醇（无 RNA 酶 70%乙 醇的配 制按 附录 A 中 A.1进行），振 摇 1 分 钟，再 于 4 下，12 000 转/分 钟离 心 5 分钟，尽 弃上 清。敞口 离心 管，于超 净工作台中 室温 晾干 沉淀。加 入 30 L 50 L 无 RNA 酶 的水（无 RNA 酶 的水 的配 制按附 录 A 中A.2 进行）溶解RNA 沉 淀，立即 用于RT-PCR 或保 存于 80 备 用。同 时设 置阳 性对 照、阴 性对照 和空 白对 照。RNA操作时 外源 性RNA 酶 消除 方法按 附 录 B 进 行。个人 防护和 实验 室安 全行 为 等 应按GB 19489 执行。也可采 用等 效商 业化 的 RNA 抽提 试剂 盒。8.3 RT-PCR 操作 8.3.1 cDNA 合成 对 每一份 样品，在一 支无RNA 酶的0.2 mL PCR 管中，加 入1.5 L 10 M引物MrTV572R1，2.5 L 无RNA酶 水和2 L 待测 样品RNA 模板。混 匀后，稍 离心，置于70，10 分钟，然 后立即 置于 冰中。加 入2 L 5 M-MLV 逆 转 录 酶 缓 冲 液、1 L RNasin(40 U/L)、0.5 L 10 mmol/L dNTPs、0.5 L M-MLV逆转录 酶(200 U/L)，42 保温1 小 时，以合 成cDNA，然 后于80 中5 分钟 后，迅 速置 于冰 中。8.3.2 第一 轮 PCR 扩增 对每一 份样 品，取一 支无RNA 酶的0.2 mL PCR 管，加 入2.5 L 10 PCR 缓冲液、0.5 L 10 mmol/L dNTPs、0.5 L 10 M 引物MrTV572F1、0.5 L 10 M 引物MrTV572R1、0.5 L Taq DNA 聚合 酶(5 U/L)、18.5 L 无RNA 酶水 和2 L 8.3.1 步 骤的 逆转 录产 物，最终反 应体 系为25 L。在PCR 后 区，置于PCR 仪 中，按以下 程序 进行 第一 轮PCR 扩增：a)95 预变 性 3 分 钟；b)94 变性 30 秒62 退火 30 秒72 延伸 40 秒，35 个循 环；c)72 延伸 7 分钟。8.3.3 第二 轮 PCR 扩增 对每一 份样 品，取一 支无RNA 酶的0.2 mL PCR 管，加入5 L 10 PCR 缓冲 液、1 L 10 mmol/L dNTPs、0.5 L 10 M 引物MrTV472F2、0.5 L 10 M 引物MrTV472R2、1 L Taq DNA 聚 合酶(5 U/L)、41.0 L无RNA 酶水，最 后加 入1 L 8.3.2 步 骤的 扩增 产物，最终反 应体 系为50 L。在PCR 后 区，置于PCR 仪 中，按以下 程序 进行 第二 轮PCR 扩增：a)95 预变 性 3 分 钟；b)94 变性 30 秒62 退火 30 秒72 延伸 40 秒，35 个循 环；c)72 延伸 7 分钟。8.4 琼脂糖 电泳 DB33/T 2287 2020 5 用1 电泳 缓冲 液（1 电 泳缓冲 液的 配制 按附 录A 中A.3进 行）配制2%的 琼脂 糖 凝胶（含0.5 g/mL EB，按 附录A中A.4稀释20000 倍 配制 而得；或 其他 等 效商品 化试 剂）。将 其放 入水平 电泳 槽中，使 电泳缓冲液 刚好 淹没 胶面，将5 L PCR 扩 增产 物和1 L 6 载样 缓冲 液（6 载样 缓 冲 液配 制按 附录A中A.5进行）混匀后 加入 样品孔，在电 泳时设 立DNA 分子 量 标准。5 V/cm 电泳 约0.5 小时，当溴酚 蓝到 达底 部时停止，在 紫外 透射 仪或 凝胶成 像仪 下观 察并 拍照 记录。9 结果判 定 9.1 阳性对 照第 一 轮PCR 后在572 bp 和/或第 二轮PCR 在 472 bp 处有 特异 条带，阴性对 照 在 572 bp和472 bp 处均 无条 带，且 空白对 照不 出现 任何 条带，实验 有效。否 则，应在 排除故 障和 清除 污染 后，重新取 样检 测。9.2 当被检 样品 第一 轮PCR 产 物在572 bp 处 有条 带和/或第二 轮PCR 后在 472 bp 处有特 异条 带，且PCR 产 物测 序 结 果同 参考 序列（参见 附 录 C）相符 的，可 判定 为套 式 PCR 结 果阳性。9.3 当被检 样品 第一 轮PCR 产 物未见 大小 为572 bp 条 带 且第二 轮 PCR 产 物未 见大 小为 472 bp 的 条带，或经测 序确 定不 是MrDV-1 的，可 判定 为套 式PCR 结 果阴性。9.4 电泳结 果分 析和 问题 排除 方法见 表 1。表1 套式 RT-PCR 产 物的 电泳 结 果分析 实验结果 结果判读及原因分析 对应原因的问题排除 罗氏沼虾样品 第一轮PCR扩增：阳性对照和阳性样品在572 bp 处会有特定条带；阴性对照在572 bp 处无任何条带，以无RNA 酶水 为 模 板 设 立 的 空 白 对 照 无 任 何 条 带出现。第二轮PCR 扩 增：阳 性 对 照 在472 bp 处 会 有 特 定 条 带 出 现；阳 性 样 品 在472 bp 处会有特定条带出现；阴 性对照在472 bp 处无任何条带，以无RNA 酶水为 模 板 设 立 的 空 白 对 照 无 任 何 条 带 出现。1 RT-PCR 反应正常，结果有效。阳性对照有条带，但分子量标准没有影像。1 分子量标准失效或加样量太少。1.更换分子量标准或增加其加 样量。分子量标准有影像，但阳性对照无条带。1 套式RT-PCR 反应失败。2 阳性对照失效。3 逆转录产物成份抑制PCR。1.检查逆转录及PCR 反应，并更 换所用试剂，纠正出错程序。2.更换阳性对照，重新实验。3.稀释逆转录产物或纯化cDNA。阴性对照组或空白对照组在第一次PCR扩增后572 bp 处有特定条带；第二次PCR 扩增后在472 bp 处 有 条 带 出现。1 微量移液器污染。2 试剂污染。3 环境污染。4 操作污染。1.清洗微量移液器，只能用PCR 后区的微量移液器跑电泳。2.更换试剂。3.清洁实验室及所用仪器设备。4.不得从PCR 后区到PCR 前区的 交流，加强操作隔离。DB33/T 2287 2020 6 表1 套式RT-PCR 产物 的 电泳结 果分 析（续）实验结果 结果判读及原因分析 对应原因的问题排除 阳性对照和阴性对照组正常，但已知带毒样品无条带。1 RNA模板降解或提取RNA 失败。2 逆转录或PCR抑制物介入。1.检查与RNA 接触的试剂和用 品，重新提取RNA。2.检 查 逆 转 录 和PCR 试 剂，重 新 合 成cDNA 和PCR。分子量标准正常，但阳性对照、阴性 对 照 和 样 品 出 现 较 多 杂 带 或 明 显 的弥散区。1 未 注 意 低 温 操 作，使PCR 出 现 非 特异性扩增。2 酶 活 性 变 化、dNTPs 浓 度 变 化 或10 PCR 缓冲液浓度变化。3 反应温度控制异常。1.做好低温操作，RT-PCR 全程 在冰上操作。2.确认预混物制备的准确性、试剂质量，10PCR 缓冲液需完全溶解 后使用。3.检查PCR 仪温控。琼脂糖凝胶片上无任何影像，包括DNA分子量标准。1 紫外观察仪有故障。2 背景发红太亮。3 凝胶太厚。4 电极颠倒或电泳时间过长。5 EB分解失效。1.检查紫外观察仪。2.减少EB用量，将琼脂糖凝胶置于清水中30 分钟后再观察结果。3.重新制作琼脂糖凝胶片。4.改正电极方向，重新加样电 泳。5.重新配制溴化 乙锭(EB)。DB33/T 2287 2020 7 A A 附 录 A（规范 性附 录）试剂配 制方 法 A.1 无RNA酶的 70%乙醇 无水乙 醇(新开 瓶)70 mL 加入无RNA 酶的 水 30 mL 在无RNA 酶的 玻璃量 筒中 配 制，混 匀，按1.0 mL/支 分 装于无RNA酶的1.5 mL 微 量 离心管 中，保 存于20 待 用。A.2 无RNA 酶 的水 水 1000 mL DEPC 1 mL 盖上瓶 塞，用磁 力搅 拌器 于37 剧 烈搅 拌12 小时，按50 mL/瓶200 mL/瓶 分装于 无RNA 酶 的试 剂瓶内，透气 高压 蒸汽 灭菌15 分钟，冷 却后 密封 保存。DEPC 有 毒，应避 免吸 入、吞食和 沾着 皮肤，操 作在 通风橱 中进 行。A.3 1 电泳 缓冲 液 Tris 4.84 g 冰乙酸 1.142 mL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)2 mL 加水定 容至 1000 mL 室温储 存。A.4 10 mg/mL EB 贮存液 EB 10 mg 水 1 mL 完全溶 解后，室 温保 存于 棕色瓶 中。A.5 6 载样 缓冲 液 蔗糖 40 g 加水溶 解，定容 至 100 mL 溴酚蓝 0.25 g 溶解后，4 储 存。DB33/T 2287 2020 8 B B 附 录 B（规范 性附 录）外源 性RNA 酶污 染消 除方 法 B.1 一般介 绍 在RNA 操作 过程 中，应严 格 防止RNA 酶 污染。外源性 的RNA 酶污染 是指 来 自于水、玻璃 制品、塑料 器皿、电泳槽、操 作人员 和微生 物等。可通 过DEPC、氯仿、干 热烘 烤等 方法来 消除。本 附录 主要 介绍外 源性RNA 酶的 消除 方 法。对DEPC、酚 和胍 盐等 有毒 或有腐 蚀性 物质，采 取措 施避免 吸入、吞 食和 沾着 皮肤；处理DEPC 和氯仿的操作 均应 在通 风橱 内进 行。B.2 溶液配 制 直接用 于RNA 操 作的 所 有 水 或无机 盐溶 液都 应加 入DEPC 至终 浓度0.1%，搅 拌12 小时，然后 经121 高压蒸 汽灭菌15 分 钟。不 能用DEPC 处 理的试 剂(如含有Tris 的溶 液)或者 不能 经 高压蒸 汽灭菌 的试 剂，应使用 经DEPC 处 理的 水配 制，然 后经 无RNA酶的0.22 m 微孔 滤膜 过滤 除菌。B.3 玻璃制 品 玻璃器 皿洗净 后，在180 烘烤4 小时 可彻 底除去 器皿上 沾污的RNA酶。不 得 用任何 在180 下可燃烧、变性 或融 化的 材料 包裹器 皿。金属 制品 也可 按玻璃 制品 的办 法处 理。B.4 聚丙烯 塑料 制品 聚丙烯 塑料 制品 可在 通风 橱内用 氯仿 漂洗，晾干 后 再经高 压蒸 汽灭 菌，最 后 烘干。也 可在 加有0.1%DEPC的 水中 浸泡12 小时，然后经 高压 蒸汽 灭菌，最 后烘干。可购买 无RNA 酶 的一 次性 塑 料制品，如 塑料 离心 管、PCR 管、枪头 等，直接 使用。B.5 人工操 作 处理RNA 的 全部 操作 应戴 无RNA酶 的塑 料或 乳胶 的一 次 性手套，同 时避 免因 交谈 或 其它活 动造 成的 飞沫、落 尘带 入RNA 酶 的污 染，必要 的情 况下 戴口 罩和 实验帽，或 在 超 净工 作台 中进行 操作。B.6 防微生 物污 染 所有接 触RNA 的 试剂 和材 料 都应保 持无 菌，一旦 有微 生物污 染应 丢弃。DB33/T 2287 2020 9 附 录 C（资料 性附 录）罗氏沼 虾双 顺反 子病 毒-1 套式 RT-PCR 检 测产 物序 列（GeneBank 登 录号：NC_018570）4524 ATGTAGAGCGTGGAGGAGTAAAAGTAGATATAGTTATTTGCGAATTAGGTGCTTCTATTT4582 CGGCTCGTAAGGGTATAGTGTCTTATTTTCCGCGCGTGAATGAGTTGTCTAGTCTTAGTG4642 GTTTAATGGCTAACGGTGAGTTAAGAGTATTTACAACAACCAATTTTGGTAAATTCAATT4702 TTCTAATTCCCAAAGATTCTTCTGCTATCTTTACTAGGGTTGTGGATCATGTAGAGTCTA4762 GATCACCAGAAGGTTCTTCGTATTATATAAGGCAAGGTTTTGAAGCAAAGGGAAATTCTG4822 TTCATGGTGATTGTTGTGCTCCCTACATAATGTTTAATCCGTCTTCGCGTGCTAAGATTG4882 TGGGTCTCCATTGTGCTGGATTTGCTCAGACATCTCGAGTGTTTGCTCAAATGATAACGC4942 AGGAGGATATTGCTAGTGCTATGCCCACAACTCATGCAGGACGAGTTTCTACAGAATTTC5002 CAAATACTTACATTTCGGAGTCCCCTCTCCCTAATTCGTTGTATATTGGTTCAGTGAAAA5062 CTGCCCCCAATCCCTCGAAGACAGAGATAGTG _ MrTV572R1 MrTV472F2 MrTV572F1 MrTV472R2