牛呼吸道疾病综合征病原PCR检测技术规范DB2306／T 185-2023.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 41 2306 黑 龙 江 省 大 庆 市 地方标准 DB 2306/T 1852023 牛呼吸道 疾病综合 征病原 PCR 检测 技术规范 2023-12-31 发布 2024-01-31 实施 大庆市市 场 监督 管 理局 发 布 DB 2306/T 185 2023 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 环 境与 设施.1 5 仪 器设 备.1 6 试 剂与 材料.2 7 样 本前 处理 与核 酸提 取.2 8 扩 增体 系与 反应 条件.2 附录A（规 范性）病料 采集和 常规 处理.9 参考文 献.10 DB 2306/T 185 2023 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 这些 专利的 责任。本 文件 由大 庆市 农业 农村 局提出 并归 口。本 文件 起草 单位：黑龙 江 八一农 垦大 学、黑 龙江 农 业职业 技术 学院、双鸭 山 市农业 技术 综合 服务 中心。本 文件 主要 起草 人：朱战 波，周 玉龙，刘 宇，张泽 财，韩 天惠，刘 云，卢群，于立 权，马金 柱，陈楠楠，阙桃 林，倪宏 波，闻晓波，张 晓轩，侯 喜林，崔玉 东 DB 2306/T 185 2023 1 牛 呼吸道 疾病综合 征病 原 PCR 检测 技 术规范 1 范围 本文件 规定了 牛呼 吸道疾 病综合 征病原PCR检 测技 术 的环境 与设施、仪 器设备、试剂 与材料、样 本前处理 与核 酸提 取、扩增 体系与 反应 条件 等要 求。本 文件 主要 适用 于牛 呼吸 道疾病 综合 征主 要病 原的PCR 检测 和分 子鉴 定。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 18637 牛 病毒 性腹 泻/粘 膜病 诊断 技术 规范 GB/T 27981 牛 传染 性鼻 气管炎 病毒 实时 荧光PCR 检 测方法 NY/T 541 兽医 诊断 样品 采集、保存 与运 输技 术规 范 NY/T 3234 牛 支原 体PCR 检测方 法 SN/T 1129 牛 病毒 性腹 泻/粘膜 病检 疫技 术规 范 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。牛呼吸 道疾 病综 合症 bovine respiratory disease complex，BRDC 由多病 原引 起牛 的一 类呼 吸系统 感染 损伤 的疾 病总 称。通 常由 应激、原 发性 病 毒感染 和继 发性 细 菌感染引 起，导致 牛的 高发 病率和 死亡 率。4 环境与 设施 实验室 资质 及级 别要 求 具 有 与 采集 病 料相 适 应的动 物 病 原微 生 物实 验 室条件 和 生 物安 全 防护 水 平相适 应 的 设备，以及 防止病原 感染 和扩 散的 有效 措施。操作人 员资 质及 防护 要求 操作人 员有 从业 资质，符 合上岗 要求。5 仪器设 备 DB 2306/T 185 2023 2 生 物安 全柜、4 离 心 机、PCR 仪、漩 涡震 荡器、水平 电泳 仪、凝胶 成像 系统、恒温 水浴 锅、实时荧光 定 量 PCR 扩增 仪等。6 试剂与 材料 试剂 核酸提 取试 剂盒、反转 录 试剂盒、脱氧 核糖 核苷 酸 三磷酸（dNTPs）、PCR 缓 冲液、RNA 酶抑 制剂、细菌总DNA 提 取试 剂盒、PBS 溶液、Trizol Reagent 试剂、无水 乙醇、超 纯水 等。材料 玻璃平 皿，玻璃 烧杯（100 mL、500 mL、1000 mL），量筒（100 mL、200 mL、500 mL、1000 mL）、镊子（含 弯头 镊子），手 术刀，组 织研 磨棒，剪刀（含 弯头 剪刀），载 玻片，酒 精灯，移液 枪（10 L、200 L、1000 L）等。离 心管（1.5 mL、2 mL、15 mL、50 mL），采样管（5 mL），移液 器吸头（10 L、200 L、1000 L），棉拭子，注 射器（5 mL、10 mL、20 mL），一次性 采 血管（含针 头），PCR管（200 L）等。7 样本前 处理 与核 酸提 取 样本前 处理 样本采 集遵 循 NY/T 541 的 规定，见附 录 1。核酸提 取 按 RNA 或 DNA 核酸 提取 试剂盒 说明 书操 作。8 扩增体 系与 反应 条件 牛传染 性鼻 气管 炎病 毒 8.1.1 聚合酶 链反 应（PCR）检测 8.1.1.1 引物 选择 IBRV 的 gI 糖蛋白 基 因区序 列设 计引 物，序列 如下：上游引 物：5-CACGGACCTGGTGGACAAGAAG-3(624-645)下游引 物：5-CTACCGTCACGTGAGTGGTACG-3(1070-1091)目的片 段大 小 468 bp。8.1.1.2 操作步 骤 扩增体 系：上、下游 引物 各 50 pM，脱氧 核糖 核苷 酸三磷 酸（dNTPs）20 mM，PCR 缓冲 液（MgCl 2 50 mM）20 mM，Taq DNA 聚合 酶 0.75 L，样 品 DNA 体积 5 L；加入无 菌的 不含 核糖 核酸酶的双 重蒸 馏水，使 其总 容积 为 50 L。DB 2306/T 185 2023 3 反应条 件：共进 行 35 个 循 环；每 个温 度循 环 由 95 60 s、57 60 s 和 72 60 s 组 成。最后 1个循环 结束 时，在 72 下 延长 6 min。8.1.1.3 结果判定 用 IBRV 特 异性 引物 对分 离培养 物 和 IBRV 标 准株 进行 PCR 扩 增，若发 现分 离培养 物 和 IBRV 标准株均 能扩 增出 与目 的基 因片段 大小 一致 的特 异性 条带，扩增 结果 清晰，无 杂带，则为 阳性。8.1.2 实时荧 光定 量PCR（qPCR）检测，遵 循GB/T 27981 标准执 行。8.1.2.1 引物和 探针 选择 IBRV 的 gB 基 因序 列 设计引 物和 探针，序 列如 下：上游引 物：5-TGTGGACCTAAACCTCACGGT-3(5749957519)下游引 物：5-GTAGTCGAGCAGACCCGTGTC-3(5759557575)探针序 列：5-FAM-AGGACCGCGAGTTCTTGCCGC-TAMRA-3(5752557545)参考基 因序 列 为 GenBank 登录 号 AJ004801。8.1.2.2 操作步 骤 扩增体 系：添 加 2 real-time PCR 混合 液 12.5 L，ROX 参 考染 料 0.5 L，上、下游引 物（4.5 M）各 1.0 L，探针（3 M）1.0 L，无核酸 酶水 4 L，DNA 模版 5.0 L。反应 条 件：50 2 min，95 2 min，1 个循 环；95 15 s，60 45 s，45 个 循环。8.1.2.3 结果判 定 通常根 据所 选择 的设 备分 析软件 说明 设定 阈值，来 自阴性 动物 病毒 分离 阴性 样本，用做 检测 系统的背景 信号。每 次检 测反 应应该 包括 阴性 对照、阳 性对照 和试 剂对 照。来自 阴性牛 的肺 组织 或者 鼻液作为阴 性对 照；自然 感染 牛阳性 样本 作为 阳性 对照（阳性 对照 可以 用阴 性样 本掺 入 IBRV）。阳性结 果：任何 与扩 增曲 线相关 的循 环阈 值（Ct）小于等 于 45 的 样本 都视 为 阳性。阳性 对 照 Ct值应该 在可 接受 的范 围内（3Ct 值），为 了尽 量减 少阳性 对照 造成 的污 染风 险，应 采用 稀释 使 CT 值在 30-33 之 间。阴性结 果：未检 测 出 Ct 值 的样本 应判 定为 阴性。阴 性对照 和未 添加 模板 应检 测不 出 Ct 值。牛病毒 性腹 泻病 毒 8.2.1 逆转录-聚 合酶 链反 应（RT-PCR）检测，具 体遵 循 SN/T 1129 标 准执 行。8.2.1.1 引物 根据BVDV 病毒 株基 因序 列5UTR 设计 合成 一对 特异 性 引物，序列 如下：上游引 物：5-AGGCTAGCCATGCCCTTAGT-3 下游引 物：5-TCTGCAGCACCCTATCAGG-3 目的片 段大 小244 bp。8.2.1.2 操作步 骤 扩增体 系：总 体系25，添 加10 RT-PCR 缓冲 液2.5 L，MgCl 2（25 mmoL/L）5 L，dNTP（各10 mmoL/L）2.5，RNasin（40 U/）0.5，AMV 反 转录 酶（5 U/）0.5，Tag DNA 聚 合酶（5 U/L）0.5，DB 2306/T 185 2023 4 上下游 引物 各0.5 L，RNA 模板5.0 L，DEPC/ddH 2O 9.5 L。反应条 件：42 40 min；92 3 min；92 15 s，58 30 s，72 1 min，40 个 循环；72 10 min，4 保存。8.2.1.3 PCR 结 果判 定 将PCR 扩增 产物10 L 与2 L 上样缓 冲液 混合，分 别加 入1%琼 脂糖 平板（含EB 终浓 度0.5 g/mL）；阴性样品 无条 带，阳 性样 品 有一条 带，大 小约 为244 bp，在 阴性 和阳 性对 照成 立 情况下，如被 检样 品无 条带，则 结果 为阴 性。如被检 样品 有条 带，大小 为244 bp，与阳 性样 品相 同，即 可判 定为 阳性。8.2.2 逆转录-实 时荧 光定 量（RT-qPCR）检测，遵循GB/T 18637 标 准执 行。8.2.2.1 引物 根据BVDV 的 非 编码 区 合成 引物 和探 针，序列 如下：上游引 物：5-CCGCGAMGGCCGAAAAGA-3 下游引 物：5-TGACGACTNCCCTGTACTCAG-3 探 针序 列：5-FAM-CCATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-BHQ1-3 8.2.2.2 操作步 骤 扩增体系：5 RT 缓 冲液（Mg2+浓度15 mmoL/L）5.0，dNTP（2.5 mmoL/L）1.0，（），上、下 游引物（），探针（），反转 录酶（），酶抑 制 剂（），T aq 酶（），无 核酸酶 水。反应 条 件：反转 录42 30 min（或 按反 转录酶 说明 书 进行设 定）；预 变性94 3 min；92 15 s，45 30 s，72 60 s，5 个循环；92 10 s，56 60 s，40 个 循环，根 据收 集 的荧光 曲线 和Ct（或Cp）值判定 结果。8.2.2.3 结果判 定 结果分 析条 件设 定：根据 仪器噪 声情 况对 阙值 设定 进行调 整，以值 线刚 好超 过阴性 对照 品扩 增线 的最高点 为准。根据Ct（或Cp）值 对试 验结 果进行 描述 及判 定，描 述 和判定 分为：无Ct（或Cp）值，且无 扩增 曲线，表示样 品中 无BVDV 核酸，判为阴 性；Ct（或Cp）值35，且 出现典 型的 扩增曲线的 样品需 复检。复检仍出现 上述结 果的，判为阳 性。否则 判为 阴性。牛副流 感病 毒3 型 8.3.1 逆转录-聚 合酶 链反 应（RT-PCR）检测 8.3.1.1 引物 选择核 衣壳 蛋 白 基因 序 列设计 引物，序 列如 下：上游引 物：下游引 物：目的片 段大 小。DB 2306/T 185 2023 5 8.3.1.2 操作步 骤 扩增体 系：r T a q bufer 2.5 L，dNTP（2.5 mM）1.0 L，上、下游 引物（20 M）各 1.0 L，r Taq（5 U/L）0.2 L，ddH 2O 17.3 L，cDNA 模板 2.0 L。反应条 件：94 预变 性 5 min；94变性 50 s，50 退火 50 s，72 延伸 50 s，共 30 个循 环；最 后72延 伸 10 min。PCR 产 物于 4 保 存。8.3.1.3 结果判 定 取反应 产 物 L，加入 适 量的上 样缓 冲液，混 后 于 琼脂 糖凝 胶（浓度为）中 电压下 电 泳，凝 胶 成像系 统观 察并 照相。阴 性对照 无目 的基 因和 其他 杂带出 现（水），阳 性对照（阳性 样本）出 现 大 小的 目的 基因 为阳性。8.3.2 逆转录-实 时荧 光定 量（RT-qPCR）检测 8.3.2.1 引物 选择牛 副流 感病 毒 型的 基因 设计 的引 物和 探针，序列 如下：上游引 物：下游引 物：探针序 列：目的片 段大 小。8.3.2.1.1 操作步 骤 扩增体 系：，上、下 游引 物（）各，水，模板，探 针。反应条 件：激活；变 性；以、扩增 个 循环，在 进行 荧光 收集。8.3.2.1.2 结果判 定 通常根 据所 选择 的设 备分 析软件 说明 设定 阈值，来 自阴性 动物 病毒 分离 阴性 样本，用做 检测 系统的背景 信号。根据Ct（或Cp）值 对试 验 结果进 行描 述及 判定，描 述和判 定分 为：无Ct（或Cp）值，且无 扩增曲线，表 示样 品中 无 核 酸，判 为阴 性；Ct（或Cp）值35，且 出现 典型的 扩增 曲线 的样 品需 复检。复检 仍出 现上 述结果的，判 为阳 性。否则 判为阴 性。牛呼吸 道合 胞体 病毒 8.4.1 逆转录-聚 合酶 链反 应（RT-PCR）检测 8.4.1.1 引物 根据 王 嵩等 人错误!未找到引用源。报 道，选择 保守 性较 强的 基因设 计的 引物，序 列如 下：上游引 物：下游引 物：DB 2306/T 185 2023 6 目的片 段大 小。8.4.1.2 操作步 骤 扩增体 系；总体 系 体系中 进行，T aq，（），上、下游引物（）各，模板，后加（）。反应条 件：预变 性、变性，延 伸，个循环，再 延伸。8.4.1.3 结果判 定 产 物经 的琼 脂糖 凝 胶电泳 检测。阴 性对 照无 目的基 因和 其他 杂带 出现（水），阳性 对照和样 本出 现 大小 的目的 基因 时，样本 判定 为阳性。8.4.2 逆转录-实 时荧 光定 量 PCR（RT-qPCR）检测 8.4.2.1 引物 选择 基 因序 列的 共 有保守 区域 设计 引物，序 列 如下：上游引 物：5-3 上游引 物：5-3 目的片 段大 小：。8.4.2.2 操作步 骤 扩增体 系：，上、下 引物（）各，水，模板。反应条 件：，个 循环。8.4.2.3 结果判 定 根据Ct（或Cp）值 对试 验 结果进 行描 述及 判定，描 述和判 定分 为：无Ct（或Cp）值，且无 扩增 曲线，表 示样 品中 无BRSV 核 酸，判 为阴 性；当Ct（或Cp）值35，且出 现典型 的扩 增曲 线的 样品 需复检。复 检仍 出现 上述结果 的，判为 阳性。反 之则判 为阴 性。牛多杀 性巴 氏杆 菌 8.5.1 聚合酶 链反 应（PCR）检测 8.5.1.1 引物 根据何 泊宁 等人错误!未找到引用源。报 道，选择 多杀 性巴 氏杆 菌外膜蛋白（OmpH）基 因序列 设计 引物，序列如 下：上游引 物：5-GACGAGCTCTTAGCAGTCGCAGCAGTA-3 下游引 物：5-GGGGTCGACTTAGACATTGCCTTTTGTTGTTACG-3 目的片 段大 小 978 bp。8.5.1.2 操作步 骤 DB 2306/T 185 2023 7 按细菌 总 提取 试剂 盒 说明书 提取 致病 菌基 因组 总。扩增体 系：上、下游 引物（20 M）各 0.5 L，Premix 2 Taq MasterMix 12.5 L，去 离子 水 10.5 L，DNA 模板 1.0 L。反应条 件：预变 性；变性，退 火，延 伸（共 个循环），终延 伸。结 果判 定 取 产物 用经 染色 的 琼 脂糖 凝胶 进行 电泳，电泳 时选 用，电泳结束 后采 用凝 胶成 像系 统观察 并拍 照记 录实 验结 果。阴性对 照无 目的 基因 和其 他杂带 出现（水），阳性 对 照（阳 性样 本）出 现 978 大小 的目 的基 因为阳性。将 产物 送公 司进行 测序。牛化脓 隐秘 杆菌 8.6.1 聚合酶 链反 应（PCR）检测 8.6.1.1 引物 根据王 密等 人错误!未找到引用源。报道，选择 扩 增 的引物，序 列如 下：上游引 物：5-GGGGCTTTTTGTTTTGGTGG-3(70-90)下游引 物：5-TCTCTGGCACATCGCAGTGTAT-3(975-997)目的片 段大 小 927 bp。8.6.1.2 操作步 骤 扩增体 系：10PCR buffer 2.5 L，dNTP（2.5 mM）2.0 L，上、下游 引物（20 M）各 0.5 L，LA T aq（2.5 U/L）0.25 L，超纯水 18.75 L，DNA 模板 2.0 L。反应条 件：95 预变 性 5 min；94 变性 30 s，53 退火 30 s，72 延伸 90 s，30 个循 环；72 延伸 10 min。8.6.1.3 结 果判 定 扩增产 物进 行 1%琼脂 糖凝 胶电泳 鉴定，胶 回收 试剂 盒回收、纯 化 DNA，于 4 保存。阴 性对 照（水）无目 的基 因和 其他 杂带出 现，阳性 对照（A.p yogenes 阳性 样本）出 现 约 927 bp 大小 的目 的基 因为阳性。牛支原 体 8.7.1 聚合酶 链反 应（PCR）检测，遵 循NY/T 3234 标准 执行 8.7.1.1 引物 选择牛 支原 体的 基因 序列 设计引 物，序列 如下：上游引 物：5-TTTTAGCTCTTTTTGAACAAAT-3 下游引 物：5-GGCTCTCATTAAGAATGTC-3 扩增基 因片 段长 度1.9 kb。8.7.1.2 操作步 骤 病料经 常规 处理，DNA 提 取试剂 盒提 取模 板。DB 2306/T 185 2023 8 扩增体 系：上、下游 引物（10 M）各0.5 L，5U/L rTaq DNA 聚 合酶0.5 L，25 mmol/L MgCl 2 2.0 L，ddH 2O 15.0 L，DNA 模板2.0 L，10 PCR Buffer(Mg2+free)2.5 L，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 L。反应条 件：95 预变 性5 min；95 变性30 s，52退火30 s，72 延伸120 s，30 个循环；最 后72 再延伸10 min。8.7.1.3 结果判 定 取 产物经 染 色的 琼脂糖凝胶进行电泳和 成 像。待检样品扩增出的DNA 片段为1.9 kb，可判定为 支原 体核 酸阳 性；未出现1.9 kb 的DNA 片 段，则可判 定待 检样 品为 牛支 原体核 酸阴 性。DB 2306/T 185 2023 9 A A 附录A（规范 性）病料采 集和 常规 处理 1.全血、血 清 用无 菌注 射器 或采 血专 用真空 管针 无菌 自病 牛静 脉采血，将 血液 直接 滴入 抗凝剂 中，并立 即连 续摇动，充分 混合。抗 凝剂 采用柠 檬酸 钠缓 冲液，或0.5 moL/L EDTA。每 6 mL 血液加1mL 抗 凝剂。直 接用于核 酸提 取。2.拭子 采 集时，将无 菌棉 拭子 反复刮 擦呼 吸道 或消 化道 粘膜，蘸 取分 泌物 后，立 即 将棉拭 子浸 入1mL2mL灭菌PBS 缓 冲液（0.01 moL/L，pH7.2），4 储 存，尽快送 达实 验室。取 样进 行检验 时，充分 振动、挤干拭子，浸 泡液 采用 4 000 r/min 离心1 min，取 上 清备用。3.组织 样品 剖检时 无菌 采集 动物 上呼 吸道粘 液、扁桃 腺、肺脏 和支气 管淋 巴结，对 流产 胎儿，采集 刚死 亡胎 儿肝肺、肾、脾 和胎 盘组 织。检测 时，用 无菌 剪、镊 取适量 样品，按1:5 的 比例 加入灭 菌PBS 缓 冲液（0.01 moL/L，pH7.2），例：1g 组织样 品加5 mL 溶液，在 研钵中 剪碎，充分 研磨，取研磨 物分 装到 离心 管中 冻融2次3 次，4000 r/min 离心5 min，取上 清备 用。4.细胞 培养 物 细胞培 养物 冻融2次3 次 分 装到 1.5 mL EP 管中4 000 r/min 离心 1 min，取 上 清备用。DB 2306/T 185 2023 10 参考文 献 1 王红，朴范 泽，侯喜林.牛呼 吸道合胞 体病毒RT-PCR 检测方法 的建立J.动物医 学进展，2008(11)：1-4.2 何 泊宁.牛多 杀性 巴 氏杆菌 分离 鉴定 及应 用噬 菌体展 示技 术筛 选TbpA 蛋 白抗原 表位D.黑龙江八一 农垦 大学，2019.3 王 密，周玉 龙，朴范 泽.牛 化脓 性隐 秘杆 菌病PCR 诊断 方法 的建 立J.微 生物学 通报，2010，37(09)：1320-1324.