鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程DB32／T 4727-2024.pdf

!7,江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布中 国 标 准 出 版 社 出 版鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 诊 断 及 综 合 防 控技 术 规 程Technical code of practice for the diagnosis，prevention，and control of infectious spleen and kidney necrosis in mandarin fish2 0 2 4-0 4-0 3 发 布 2 0 2 4-0 5-0 3 实 施CCS B 5 2DB 3 2/T 4 7 2 7 2 0 2 4ICS 6 5.1 5 0DB 3 2/T 4 7 2 7 2 0 2 4前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.12020 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 江 苏 省 农 业 农 村 厅 提 出。本 文 件 由 江 苏 省 渔 业 标 准 化 技 术 委 员 会 归 口。本 文 件 起 草 单 位：扬 州 大 学。本 文 件 主 要 起 草 人：张 晓 君、高 晓 建、姜 群、刘 晓 丹、朱 鑫 海、姜 姿 妍、周 一 凡。DB 3 2/T 4 7 2 7 2 0 2 4鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 诊 断 及 综 合 防 控技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 的 诊 断、综 合 防 控 和 记 录。本 文 件 适 用 于 鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 毒 的 检 测 以 及 鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 的 诊 断 和 综 合 防 控。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。GB 11607 渔 业 水 质 标 准SC/T 7103 水 生 动 物 产 地 检 疫 采 样 技 术 规 范3 术 语 和 定 义本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义。4 诊 断4.1 现 场 调 查水 质 情 况 包 括 水 源、水 色、水 温、透 明 度、pH、亚 硝 酸 盐、氨 氮、溶 解 氧、硬 度 等；养 殖 情 况 包 括 养 殖 密度、苗 种 来 源、饵 料 鱼 来 源 等。4.2 临 床 诊 断患 病 鱼 表 现 为 沿 池 边 漫 游 而 死，鳃 盖、口 腔 周 围、下 颌、胸 鳍、腹 鳍 充 血，鳃 发 白，解 剖 后 肝 脏 呈 现 白 色或 有 出 血 点，肾 脏 和 脾 脏 肿 大 或 有 明 显 的 出 血 点，部 分 胆 囊 肿 大，部 分 幽 门 盲 囊 出 血（见 附 录 A 图 A.1）。4.3 检 测 方 法4.3.1 试 剂 材 料试 剂 材 料：a)无 水 乙 醇（分 析 纯）；b)三 氯 甲 烷（分 析 纯）；c)异 戊 醇（分 析 纯）；d)1 mmol/L 乙 二 胺 四 乙 酸（EDTA），pH 8.0；e)1%十 二 烷 基 硫 酸 钠（SDS）；f)ddH2O；1DB 3 2/T 4 7 2 7 2 0 2 4g)10 mmol/L TrisHCl，pH 8.0，4 保 存；h)Tris 饱 和 酚，4 保 存；i)8 U/L Bst DNA 聚 合 酶，-20 保 存；j)10 mmol/L dNTPs 混 合 物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 2.5 mmol/L），-20 保 存；k)10 000SYBR Green I，-20 保 存；l)25 mmol/L MgCl2，-20 保 存；m)10LAMP 缓 冲 液，-20 保 存；n)5 mol/L 甜 菜 碱，-20 保 存；o)10PCR 缓 冲 液，-20 保 存；p)5 U/L Taq DNA 聚 合 酶，-20 保 存；q)20 mg/mL 蛋 白 酶 K，-20 保 存；r)LAMP 检 测 引 物 序 列：F3：5 AACCACCAGGCAGAAATGG3 B3：5 ATCCGAGGCGACGTCATC3 FIP：5 TAAAGCCAAAGCCCACATCGGCGAAGACATGGTGCGCTACT3 BIP：5 AAGCAAGTGCACAGCACCCGTCAAGCCTCGCACAGAGG3 s)巢 氏 PCR 检 测 引 物 序 列：M C PF1：5 ATGTCTGCAATCTCAGGT3 M C PR1：5 TTACAGGATAGGGAAGCCTG3 M C PF2：5 GCGTTTGATGCGATGGAGAC3 M C PR2：5 ACGGCAGAGACACGGTAGGC3 4.3.2 仪 器 设 备仪 器 设 备 包 括：a）灭 菌 锅；b）水 浴 锅；c）PCR 仪；d）紫 外 分 光 光 度 计；e）电 泳 仪；f）电 泳 槽；g）凝 胶 成 像 系 统；h）离 心 机。4.3.3 采 样采 集 样 品 的 数 量 见 SC/T 7103。鳜 鱼 体 表 用 75%酒 精 消 毒 后 解 剖 剪 解 剖，无 菌 操 作，剪 取 小 块 肾脏、脾 脏、肝 脏，匀 浆 后 用 于 DNA 提 取。4.3.4 检 测 样 本 模 板 制 备利 用 酚 氯 仿（三 氯 甲 烷）法 抽 提 混 合 组 织 DNA。每 个 样 品 取 组 织 100 mg200 mg，匀 浆 后 置 于1.5 mL 微 量 离 心 管，加 入 含 蛋 白 酶 K 的 裂 解 液（10 mmol/L TrisHCl，pH 8.0；1 mmol/L EDTA，pH 8.0；1%SDS），60 消 化 1 h3 h。用 Tris 饱 和 酚 三 氯 甲 烷 异 戊 醇（25 24 1）混 合 液 提 取、纯 化 DNA，-20 冷 冻 的 无 水 乙 醇 沉 淀2DB 3 2/T 4 7 2 7 2 0 2 4DNA，自 然 干 燥，溶 于 灭 菌 ddH2O。紫 外 分 光 光 度 计 测 定 DNA 浓 度 和 纯 度，琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 DNA完 整 性。DNA 样 品 置 于-20 冰 箱 保 存 备 用。4.3.5 环 介 导 等 温 扩 增（LAMP）检 测 方 法4.3.5.1 LAMP 扩 增按 表 1 加 入 各 项 试 剂 进 行 LAMP 扩 增，同 时 以 ddH2O 为 模 板 作 阴 性 对 照，以 病 毒 质 粒 作 阳 性 对 照，LAMP 的 反 应 条 件：65 保 持 60 min，80 终 止 反 应 10 min。表 1 LAMP 反 应 体 系（2 5 L）试 剂DNA 模 板内 引 物（FIP、BIP）外 引 物（F3、B3）dNTPs（10 mmol/L）10LAMP 缓 冲 液甜 菜 碱（5 mol/L）MgCl2（25 mmol/L）Bst DNA 聚 合 酶（8 U/L）ddH2O体 积L2各 1各 12.52.5421补 足 至 254.3.5.2 LAMP 检 测 结 果 判 断将 1 L 10 000SYBR Green I 荧 光 染 料 加 入 LAMP 反 应 产 物，振 荡 后 观 察 混 合 液 颜 色，绿 色 为 阳性，橙 色 为 阴 性（见 图 A.2）。4.3.6 巢 式 PCR 检 测 方 法4.3.6.1 PCR 扩 增按 表 2 加 入 试 剂 进 行 第 一 轮 PCR 扩 增，同 时 以 ddH2O 为 模 板 作 阴 性 对 照，以 病 毒 质 粒 作 阳 性 对 照，PCR 的 反 应 条 件：94 预 变 性 5 min、94 变 性 30 s、58 退 火 30 s、72 延 伸 1 min，循 环 30 次 后 72 延 伸 10 min。表 2 第 一 轮 扩 增 反 应 体 系（2 5 L）试 剂DNA 模 板M C PF1M C PR110PCR 缓 冲 液体 积L10.50.52.53DB 3 2/T 4 7 2 7 2 0 2 4表 2 第 一 轮 扩 增 反 应 体 系（2 5 L）(续)试 剂MgCl2（25 mmol/L）dNTPs（10 mmol/L）Taq DNA 聚 合 酶（5 U/L）ddH2O体 积L210.5补 足 至 25按 表 3 加 入 试 剂 进 行 第 二 轮 PCR 扩 增，以 ddH2O 为 模 板 作 阴 性 对 照，以 病 毒 质 粒 作 阳 性 对 照，PCR的 反 应 条 件：94 预 变 性 2 min、94 变 性 30 s、55 退 火 30 s、72 延 伸 30 s、循 环 30 次 后 72 延 伸 10 min。表 3 第 二 轮 扩 增 反 应 体 系（2 5 L）试 剂DNA 模 板（第 一 轮 PCR 扩 增 产 物）M C PF2M C PR210PCR 缓 冲 液MgCl2（25 mmol/L）dNTP（10 mmol/L）Taq DNA 聚 合 酶（5 U/L）ddH2O体 积L10.50.52.5220.5补 足 至 254.3.6.2 巢 氏 PCR 检 测 结 果 判 断反 应 结 束 后，取 5 L PCR 产 物，用 1%琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 分 析，采 用 凝 胶 成 像 系 统 观 察 并 记 录 结果，第 一 轮 阳 性 扩 增 片 段 的 大 小 为 1 362 bp，第 二 轮 阳 性 扩 增 片 段 的 大 小 为 526 bp，阴 性 无 扩 增 片 段（见图 A.3）。4.3.7 综 合 判 定结 合 现 场 调 查、临 床 症 状 和 分 子 生 物 学 检 测 结 果，诊 断 结 论 如 下：a）有 临 床 症 状，分 子 诊 断 阳 性 的，判 定 鳜 鱼 患 传 染 性 脾 肾 坏 死 病；b）无 临 床 症 状，分 子 诊 断 阳 性 的，判 定 鳜 鱼 携 带 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 毒；c）无 临 床 症 状，分 子 诊 断 阴 性 的，判 定 鳜 鱼 未 患 传 染 性 脾 肾 坏 死 病。4DB 3 2/T 4 7 2 7 2 0 2 45 综 合 防 控5.1 养 殖 前 准 备 工 作5.1.1 养 殖 用 水水 源 应 符 合 GB 11607 渔 业 水 质 标 准。5.1.2 池 塘 准 备5.1.2.1 池 塘 清 整冬 季 在 捕 捞 后，排 干 池 水，维 修 堤 埂 滩 脚，并 清 除 池 底 过 多 淤 泥 及 池 边 杂 草，晒 池 和 冻 池。5.1.2.2 生 石 灰 清 塘生 石 灰 清 塘 包 括：a）干 法 清 塘：池 塘 留 水 6 cm9 cm，用 10 kg/100 m230 kg/100 m2生 石 灰 清 塘；b）带 水 清 塘：按 20 kg/100 m350 kg/100 m3生 石 灰 化 浆 后 全 池 泼 洒。5.1.2.3 漂 白 粉 清 塘漂 白 粉 含 有 效 氯28%。漂 白 粉 清 塘 包 括：a）干 法 清 塘：用 量 1 kg/100 m23 kg/100 m2；b）带 水 清 塘：用 量 2 kg/100 m35 kg/100 m3，先 将 漂 白 粉 加 水 溶 化 后，立 即 全 池 泼 洒。5.1.3 苗 种 检 疫苗 种 放 养 前 进 行 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 毒 检 测。5.1.4 疫 苗 注 射鳜 鱼 苗 种 下 塘 前，按 照 说 明 书 注 射 国 家 批 准 的 鳜 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 灭 活 疫 苗（NH0618 株）。5.1.5 苗 种 放 养苗 种 放 养 前，先 放“试 水 鱼”，确 认 安 全 后，按 照 生 产 计 划 放 养。5.2 养 殖 过 程 管 理5.2.1 水 质 调 控鳜 鱼 养 殖 池 塘 水 体 溶 解 氧 宜5 mg/L，透 明 度 宜30 cm，pH 宜 为 7.58.5，每 隔 10 d15 d，使 用 生物 型 底 质 改 良 剂 和 水 质 改 良 剂 各 1 次。5.2.2 饵 料 投 喂投 喂 的 饵 料 鱼 不 携 带 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 毒，规 格 不 超 过 鳜 鱼 全 长 的 50%，投 喂 前 用 3%5%食 盐水 浸 泡 10 min15 min 消 毒。5.2.3 疾 病 高 发 期 管 理水 温 25 30 时 为 鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 发 病 高 峰 期，每 10 d 用 微 生 物 制 剂 调 节 水 质 进 行 预5DB 3 2/T 4 7 2 7 2 0 2 4防；疾 病 发 生 后 及 时 捞 除 病 鱼 及 死 鱼，无 害 化 处 理；减 少 或 停 止 投 喂 饵 料；使 用 聚 维 酮 碘 等 药 物 对 水 体 消毒 1 次2 次，防 止 交 叉 感 染。6 记 录详 细 记 录 实 际 防 控 措 施，记 录 保 存 2 年 以 上。记 录 内 容 应 包 含 苗 种 及 饵 料 鱼 来 源、用 药 量、用 药 方法、病 鱼 死 亡 情 况 等。实 际 操 作 与 复 核 人 员 需 在 记 录 上 签 字。6DB 3 2/T 4 7 2 7 2 0 2 4附 录 A（资 料 性）鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 临 床 症 状 及 LAMP 和 巢 式 PCR 检 测 结 果 示 意 图鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 临 床 症 状 见 图 A.1。标 引 序 号 说 明：A 鳃 盖、口 腔 周 围、下 颌 出 血；B 鳃 丝 发 白；C 肝 脏 发 白；D 胆 囊 肿 大；E 肾 脏 肿 大；F 脾 脏 肿 大。图 A.1 鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 临 床 症 状鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 毒 LAMP 检 测 结 果 见 图 A.2。7DB 3 2/T 4 7 2 7 2 0 2 4标引序号说明：1阳性样本；2阳性对照；3阴性对照。图 A.2 鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 毒 LAMP 检 测 结 果鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 毒 巢 式 PCR 检 测 结 果 见 图 A.3。检 测 结 果 显 示，患 鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 的样 本 和 阳 性 对 照 第 一 轮 PCR 扩 增 出 预 期 大 小（1 362 bp）目 的 条 带，第 二 轮 PCR 扩 增 出 预 期 大 小（526 bp）目 的 条 带，阴 性 对 照 组 未 扩 增 出 任 何 条 带。注：M 为 DL2 000；15 为 第 一 轮 PCR 扩 增；610 为 第 二 轮 PCR 扩 增；12 和 67 为 阳 性 样 本；3 和 8 为 阳 性 对 照；45 和 910 为 阴 性 对 照。图 A.3 鳜 鱼 传 染 性 脾 肾 坏 死 病 毒 巢 式 PCR 检 测 结 果 8