单胞藻规模化培养技术规范DB33／T 2300-2020.pdf

ICS 65.150 CCS B 51 DB33 浙江省 地 方 标 准 DB33/T 2300 2020 单胞藻 规 模化培养 技术规范 Technical specification for large-scale cultivation of microalgae 2020-12-30 发布 2021-01-30 实施 浙 江 省 市 场 监 督 管理 局 发布 DB33/T 2300 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部 分：标 准化 文件 的结 构和 起草规 则 的规 定起草。本标准 由浙 江省 农业 农村 厅 提出。本标准 由浙 江省 水产 标准 化技术 委员 会归 口。本标准 起草 单位：浙 江省 海洋水 产养 殖研 究所，浙 江永兴 水产 种业 有限 公司，宁波 大学。本标准 主要 起草 人：柯爱 英、徐 继林、周 朝生、肖 国强、蔡景 波、黄振 华、曾国权、胡 园、朱 洁、吴越、王瑶 华。DB33/T 2300 2020 1 单 胞藻规 模化培养 技术规 范 1 范围 本 标准 规定 了 单 胞藻 规模 化培养 的培 养条 件 和 设施、培养 方法、日 常管 理、收获和 保存 等内 容。本标准 适用 于水 产苗 种培 育 和养 殖生 产中 的单 胞藻 培养。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过规 范性文 件的 引用 而构 成本 标准必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期的 对应 版本 适用 于本标 准；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本标准。GB 11607 渔业 水质 标准 NY 5051 无公 害食 品 淡 水养殖 用水 水质 NY 5052 无公 害食 品 海 水养殖 用水 水质 3 术语与 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 标准。3.1 指 数生 长 期 细胞迅 速生 长繁 殖，藻细 胞数量 随着 培养 时间 的延 长呈几 何级 数递 增 的 时期。3.2 一 级培 养 以0.3 L5.0 L 广口 瓶或 三角烧 瓶作 培养 容器，严 格消毒，用 滤 纸 封口 的培 养方式。3.3 二 级培 养 用 容积 为50 L 100 L白 塑 料桶、尼龙袋、光 生物反 应器 等 作为培 养容 器，严 格消毒，连续 充气 的培养方 式。3.4 三 级培 养 采用 育 苗场 现有 的水泥 培养 池、帆布 池等 作为 培养 容器，消毒，连 续充 气的 培养方式。4 培养条 件 和 设施 4.1 培养用 水 海水应 符合GB 11607、NY 5052规定。淡水应 符合GB 11607、NY 5051规定。4.2 设施设 备 DB33/T 2300 2020 2 主要有 蓄水 池、沉淀 池、过滤池、输 水管、保种 室、培养 池、光 生物 反应 器 等设施。场地 要 求光 线明亮，通风 条件 好，配备 显微镜、生 物培 养箱、空 调、冰 箱等 设备。配 套供 水、供 气、供电 设施。4.3 培养容 器 一级 培 养的 容器 主要 有0.3 L5.0 L的 三角 烧瓶，二 级培养 主要 采用10 L 20 L 玻璃广 口瓶、50 L 100 L 白色 塑料 桶、光生 物 反应器 等；三级 大面 积培 养主要 采用 水泥 池、帆布 池 等。5 培养方 法 5.1 器具消毒 5.1.1 高温消 毒法 5.1.1.1 培养用 的玻 璃器 皿和 金属 工具适 用于 煮沸 消毒、烘 箱干燥 消毒、高 压灭 菌等 高温消 毒；5.1.1.2 培养用 的充 气管、散 气石 适用于 煮沸 消毒。消 毒的 方法见 附 录 A。5.1.2 化学药 品消 毒法 5.1.2.1 酒精消 毒适 用于 手、镊子、瓶口 的消 毒。5.1.2.2 将高锰 酸钾、漂 白粉 或漂 白片、盐酸 配成 溶液 适用 于玻璃 器具、塑 料容 器、充气管、散 气 石、玻璃缸、水 泥池、管 道等 消毒。消毒 方法 见附 录 A。5.2 培养用 水消 毒 5.2.1 加热消 毒法 5.2.1.1 一级培 养用 的水 经砂 滤、脱脂棉 过滤，煮 沸 5 分钟 10 分钟，冷 却后 使用。5.2.1.2 二级培 养用 水经 砂滤、250 目筛 绢袋 过滤 煮沸5 分钟 10 分钟，冷却 后使 用。5.2.2 漂白粉 或漂 白片 消毒 5.2.2.1 容积 50 L100 L 塑料桶，加水 后用 漂白 片消 毒，有效氯 浓度 为 20 mg/L 50 mg/L，中 和 去除余氯 后使 用。5.2.2.2 水泥池 加水 后泼 洒 80 目过滤 过的 漂白 水，有效 氯浓度 为 15 mg/L 30 mg/L，中和去 除余 氯后使用。5.2.2.3 光生物 反应 器直 接注 入 有 效氯浓度 为 50 mg/L 100 mg/L 漂白 水消毒，中和 去 除余氯 后使 用。光生物 反应 器长 期培 养藻 类后消 毒采 用盐 酸1000 mg/L+250 mg/L 次氯 酸钠 混 合消毒 液在 缓冲 罐里，用水泵循 环到 管道 里，消毒 混合液 可以 重复 使用。5.3 接 种 5.3.1 藻种质 量 藻种 应 无污 染，无杂 藻、藻 细胞 无附 壁。5.3.2 接种浓 度 接种时 间 宜 在早 上6：00 10：00 进行，藻 种在 指数 生长 后 期，一级 培养 接种 浓度为1：5 1：10；二级培 养接 种浓 度1：10 1：50；三 级培 养根 据天 气、生产 需要 来接 种，接种 浓度1：15 1：30。5.4 培养条件 水产养 殖常 用微 藻种 类生 态条件 参数 见附 录B。5.5 培养液 常用培 养液 配方 见附 录C、附录D。6 日常管 理 DB33/T 2300 2020 3 6.1 观察与 处理 6.1.1 观察 定期显 微镜 检查，从 藻细 胞的形 态、悬浮、污 染情 况 等了解 细胞 生长 是否 正常。注意 观察 藻液 颜色，有无附 壁、沉淀、菌 膜和 敌害生 物，如发 现异 常 应 立即舍弃，并及时 重新 接 种培养。6.1.2 一级培 养 空调控 温，光照 用日 光灯 调 节，每 天摇 晃 藻 种瓶4 次 6 次，培养 用的 消毒 水应 在5 天7 天 用完。6.1.3 二级培 养 二级培 养室 保持 采光 良好，自然 光照 或人 工光 源，用遮光 帘或 遮阳 布等 设施，避免 太阳 光直 射，充气量微沸、封口，定期 用 漂白水 培养 场所 进行 消毒。6.1.4 三级培 养 控 温，用遮 光帘 或遮 阳布 等设施，调 节光 照，充气 微沸。6.2 记录和 补充 培养 液 根 据藻 类的 生长 状态 和对藻 类的 需求 量收 获一 部分浓 藻液，并 补充 等量 的新培 养液 继续 培 养。对每次接种、培 养液 添加 进行 记录。7 收获 和 保存 7.1 收获 单 胞藻 经各 培养 阶段，最 终达到 苗种 及养 殖生 产单 位所要 求的 藻种 浓度 和质 量，投 喂的 单胞 藻 以 处于指数 生长 期收获。7.2 保存 培养的 单胞藻 利用500 目 尼 龙筛网 富集、暗沉 淀、加0.5 g/L 1.0 g/L 明矾或 氢 氧化钙 收集藻 类，冷藏或 冷冻 保存，以 备随 时投喂 使用。8 技术 模 式图 单胞藻 规模 化培 养技 术模 式图见 附录E。DB33/T 2300 2020 4 A A 附 录 A（资料 性）单胞藻 培养 常用 消毒 方法 单胞藻 培养 常用 消毒 方法 见表A.1 表A.1 单 胞藻 培养 常用 消 毒方法 项 目名称 煮沸 烘 箱干燥 高 压灭菌 高 锰酸钾 漂 白粉或 漂 白片 盐酸 玻璃容器 5 分钟10 分钟 120 恒温 2 小时 121，维持20 分钟 浓度10 mg/L 20 mg/L 浸泡5 分钟10 分钟 浓度10 mg/L 100 mg/L 浸泡12 小时 盐酸：水 1：1 1：5 金属工具 5 分钟10 分钟 120 恒温 2 小时 121，维持20 分钟/塑料容器/浓度10 mg/L 20 mg/L 浸泡5 分钟10 分钟 浓度10 mg/L 100 mg/L 浸泡12 小时 盐酸：水 1：1 1：5 充气管 散气石 5 分钟10 分钟/浓度10 mg/L 20 mg/L 浸泡5 分钟10 分钟 浓度10 mg/L 100 mg/L 浸泡12 小时/水泥池 玻璃缸/浓度10 mg/L 20 mg/L 浸泡5 分钟10 分钟 浓度10 mg/L 100 mg/L 浸泡12 小时 盐酸：水 1：1 1：5 光生物反应器、管道/浓度10 mg/L 20 mg/L 浸泡5 分钟10 分钟 浓度10 mg/L 100 mg/L 浸泡12 小时 盐酸：水 1：1 1：5 DB33/T 2300 2020 5 B B 附 录 B（资料 性）水产养 殖常 用微 藻种 类 生 态条件 参数 水产养 殖常 用微 藻种 类生 态条件 参数 见表B.1。表B.1 水产 养殖 常用 微藻 种类生 态条 件参 数 品种 隶属 PH 适 温范围（）盐度范围（）光照强度（）三角褐指藻 硅藻门 7.0 10.0 5 25 1535 1000 8000 小新月菱形藻 7.0 10.0 5 28 2035 1000 8000 纤细角毛藻 6.5 9.5 10 40 1030 5000 15000 牟氏角毛藻 6.5 9.5 10 40 1030 5000 15000 假微型海连藻 7.0 10.0 2030 1535 1000 10000 威氏海连藻 7.0 10.0 2030 1535 3000 10000 中肋骨条藻 7.0 10.0 10 25 1040 3000 7000 等鞭 金藻 金藻门 7.0 9.5 1535 1050 3000 9000 球等鞭金藻 7.0 10.0 1035 1050 3000 10000 叉鞭 金藻 7.0 9.5 9 35 1050 3000 15000 绿色巴夫藻 7.0 9.5 1035 5 80 3000 15000 亚心形扁藻 绿藻门 7.0 10.0 7 30 1040 1000 20000 青岛大扁藻 7.0 10.0 1035 1040 1000 10000 塔胞藻 7.0 10.0 7 30 1040 1000 20000 小球藻 6.0 8.5 1036 0 45 1000 20000 微绿球藻 7.0 9.5 1036 4 36 3000 20000 栅藻 5.0-7.5 1035 0 1000-10000 DB33/T 2300 2020 6 C C 附 录 C（资料 性）常用海洋 微 藻培 养液 配方 常用海 洋微 藻培 养液 配方 见表C.1。表C.1 常用 海洋 微藻 培养 液配方 隶属 培养液配方 成分 一级培养 mg 二级培养mg 三级培养 mg 金藻门 硝酸钠或硝酸钾 100.00 50.00 20.00 磷酸二氢钾 15.00 10.00 3.00 硫酸亚铁 或柠檬酸铁 2.50 2.50 1.5 硫酸锰 0.25 0.25/EDTA 20.00 10.00/尿素/10.00 10.00 维生素B1 0.1 0.05/维生素B2 0.0005 0.0005/碳酸氢钠 1.00/消毒水 1 L 1 L 1 L 硅藻门 硝酸钠或硝酸钾 90.00 50.00 20.00 磷酸二氢钾 20.00 4.00 3.00 硫酸亚铁 或柠檬酸铁 2.50 2.50 1.5 硫酸锰 0.25 0.25/EDTA 20.00 10.00/尿素/10.00 10.00 维生素B1 0.1 0.001/维生素B2 0.0005 0.000008/碳酸氢钠 1.00/硅酸钠 10.00 10.00 10.00 消毒水 1 L 1 L 1 L 绿藻门 硝酸钠或硝酸钾 100.00 20.00 20.00 磷酸二氢钾 20.00 4.00 3.00 硫酸亚铁 或柠檬酸铁 2.50 2.50 1.0 硫酸锰 0.25 0.25/EDTA 20.00 10.00/尿素/20.00 20.00 维生素B1 0.1 0.001/维生素B2 0.0005 0.000008/碳酸氢钠 1.00/消毒水 1 L 1 L 1 L DB33/T 2300 2020 7 D 附 录 D（资料 性）常用淡 水藻 类水生 4 号培 养液配 方 常用淡 水藻 类水 生4 号培 养 液配方 见表D.1。表D.1 常用 淡水 藻类 水生4 号培养 液配 方 成分 硫酸铵 mg/L 磷酸氢二钾 mg/L 过磷酸钙 mg/L 硫酸镁 mg/L 氯化钾 mg/L 碳酸氢钠 mg/L 三氯化铁 1%水溶液 土壤浸出液 ml 用量 200 10 30 80 25 100 1 滴 0.5 注：土壤浸出液配制：（菜园 土1 份+2份水）混合摇匀，静止，取上清液。DB33/T 2300 2020 1 D E 附 录 E（资料 性）单胞藻 规模 化培 养技 术模 式图 单胞藻 规模 化培 养技 术模 式见图E.1。图 E.1 单胞 藻规 模化 培养 技术模 式图 一级培养 二级培养 三级培养 将保种室中培养的藻种扩种到0.3 L 5 L 的玻璃瓶，用水需经过脱脂棉过滤煮沸，培养液高压灭菌或煮沸。将 经 过 滤 培 养 水 烧 开 注 入 桶内密封，冷却后加培养液，接种培养。充气管、气石煮沸消毒，培养液煮沸。将经过滤培养水注入桶内，加漂白片有效氯浓度20 mg/L 50 mg/L,充气-停气-密封，12 小时24 小时后充气加硫代硫酸钠中和，加培养液，接种培养。充气管、气石 煮沸 消 毒 或 漂 白 精 消 毒，培 养 液 煮沸。将 经 过 滤 水 加 有 效氯浓度 50 mg/L 100 mg/L,用水泵注入管道，12 小时24 小时后充气 加硫代硫酸钠中和，加培养液和30 mg/L 碳酸氢钠接种培养。将 池 子 冲 洗 干 净，加 经 过 滤 的 水 到水位 80 cm 120 cm,充 气 泼 洒 经80 目过滤的漂白粉使水体 有效 氯 浓度达 15 mg/L 30 mg/L，用漂 白水将池壁和过道淋洗，充气 30 小时 60 小时 后停气，12 小时24 小时 后泼洒硫代硫酸钠，充气 1 小时左右施肥接种。