资源描述
I C S 0 7.0 8 0A 0 4DB5132四 川 省(阿 坝 藏 族 羌 族 自 治 州)地 方 标 准D B 5 1 3 2/T 8 8 2 0 2 3牦 牛 肉 P C R 膜 芯 片 技 术 检 验 方 法I d e n t i f i c a t i o n o f Y a k M e a t w i t h P C R-m e m b r a n e C h i p T e c h n o l o g y2 0 2 3-1 0-2 6 发 布 2 0 2 3-1 2-2 5 实 施阿 坝 藏 族 羌 族 自 治 州 市 场 监 督 管 理 局 发 布D B 5 1 3 2/T 8 8 2 0 2 3I目 次前 言.I I引 言.I I I1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 和 定 义、缩 略 语.13.1 术 语 和 定 义.13.2 缩 略 语.14 原 理.25 设 备 与 材 料.26 主 要 试 剂.27 实 验 用 水.28 检 验 步 骤.28.1 P C R 引 物 及 探 针.28.2 样 品 处 理 与 D N A 提 取.38.3 多 重 P C R 反 应 体 系.48.4 膜 芯 片 制 备.48.5 杂 交 显 色.48.6 结 果 判 读.59 结 果 表 述.51 0 生 物 安 全 及 检 测 过 程 中 防 止 交 叉 污 染 的 措 施.5参 考 文 献.7D B 5 1 3 2/T 8 8 2 0 2 3I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分:标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 给 出 的 规则 起 草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 阿 坝 藏 族 羌 族 自 治 州 农 业 农 村 局 提 出 并 归 口。本 文 件 起 草 单 位:四 川 省 龙 日 种 畜 场、西 南 民 族 大 学、成 都 产 品 质 量 检 验 研 究 院 有 限 责 任 公 司、成都 鸿 宜 瑞 信 息 技 术 咨 询 有 限 公 司。本 文 件 主 要 起 草 人:何 明 珠、江 明 锋、史 贇 学、赵 睿 骁、蒲 华 荣。D B 5 1 3 2/T 8 8 2 0 2 3I I I引 言本 文 件 的 发 布 机 构 提 请 注 意,声 明 符 合 本 文 件 时,可 能 涉 及 到 专 利 号 为 Z L 2 0 1 9 1 0 4 0 0 4 5 0.2 一 种 牦牛 肉 鉴 定 试 剂 盒 相 关 的 专 利 的 使 用。本 文 件 的 发 布 机 构 对 于 该 专 利 的 真 实 性、有 效 性 和 范 围 无 任 何 立 场。该 专 利 持 有 人 已 向 本 文 件 的 发 布 机 构 承 诺。他 愿 意 同 任 何 申 请 人 在 合 理 且 无 歧 视 的 条 款 和 条 件 下,就 专 利 授 权 许 可 进 行 谈 判。该 专 利 持 有 人 的 声 明 已 在 本 文 件 的 发 布 机 构 备 案。相 关 信 息 可 以 通 过 以 下 联系 方 式 获 得:专 利 持 有 人 姓 名:江 明 锋(西 南 民 族 大 学),文 勇 立(西 南 民 族 大 学),王 誉(西 南 民 族 大 学)。请 注 意:除 上 述 专 利 外,本 文 件 的 某 些 内 容 仍 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的责 任。D B 5 1 3 2/T 8 8 2 0 2 31牦 牛 肉 P C R-膜 芯 片 技 术 检 验 方 法1 范 围本 文 件 规 定 了 牦 牛 肉 动 物 源 性 成 分 的 P C R-膜 芯 片 技 术 检 测 方 法。本 文 件 适 用 于 水 牛、黄 牛、猪、羊、鸡、兔、鸭、狗、牦 牛 肉 及 其 制 品 的 动 物 源 性 成 分 检 测,检 出限 为 1%。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的。凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件,仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件,其 最 新 版 本(包 括 所 有 的 修 改 单)适 用 于 本 文 件。G B/T 6 8 2 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法G B/T 2 7 4 0 3 实 验 室 质 量 控 制 规 范 食 品 分 子 生 物 学 检 测G B/T 3 4 7 9 6 水 溶 液 中 核 酸 的 浓 度 和 纯 度 检 测3 术 语 和 定 义、缩 略 语3.1 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1.1 聚 合 酶 链 式 反 应 p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n;P C R在 D N A 聚 合 酶 催 化 下,以 母 链 D N A 为 模 板,以 特 定 引 物 为 伸 起 点,通 过 变 性、退 火、延 伸 等 步 骤,体 外 复 制 出 与 母 链 模 板 D N A 互 补 的 子 链 D N A 的 过 程。3.1.2 多 重 聚 合 酶 链 式 反 应 m u l t i p l e x P C R在 同 一 P C R 反 应 体 系 中 加 入 两 对 以 上 引 物,同 时 扩 增 出 多 个 核 酸 片 段 的 P C R 反 应。3.1.3 膜 芯 片 技 术 m e m b r a n e C h i p T e c h n o l o g y将 预 先 制 备 的 D N A 探 针 有 序 的 固 定 于 尼 龙 膜 表 面,然 后 与 标 记 的 样 品 杂 交,通 过 对 杂 交 信 号 的 检 测分 析,得 出 样 品 的 遗 传 信 息(基 因 序 列 及 表 达 的 信 息)。3.2 缩 略 语P C R:p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n;聚 合 酶 链 式 反 应D N A:D e o x y r i b o N u c l e i c A c i d;脱 氧 核 糖 核 苷 酸S S C:S a l i n e S o d i u m C i t r a t e b u f f e r;杂 交 印 记 缓 冲 液P C R M a s t e r B u f f e r:P C R 缓 冲 液d N T P:d e o x y-r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e;脱 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸T a q P o l y m e r a s e:T h e r m u s a q u a t i c u s 聚 合 酶D B 5 1 3 2/T 8 8 2 0 2 32S S P E:核 酸 杂 交 缓 冲 液M i x:P C R 的 预 混 物,含 有 T a q 酶、d N T P 混 合 物、M g C l 2 及 优 化 的 缓 冲 体 系d d H 2 O:双 重 蒸 馏 水4 原 理针 对 牦 牛 肉 及 市 场 常 见 假 冒 牦 牛 肉 动 物 源 性 成 分 特 异 基 因 片 段 设 计 引 物,对 D N A 模 板 进 行 多 重 聚 合酶 链 式 反 应 扩 增,扩 增 产 物 与 固 定 有 目 标 基 因 特 异 性 探 针 的 膜 芯 片 进 行 杂 交,经 化 学 显 色 后 可 在 杂 交 点上 形 成 肉 眼 可 见 的 杂 交 信 号。5 设 备 与 材 料除 实 验 室 灭 菌 及 常 规 设 备 外,其 他 设 备 和 材 料 如 下:5.1 p H 计(0.0 1 级)5.2 天 平(感 量 0.1 g)5.3 P C R 仪5.4 生 物 安 全 柜5.5 膜 芯 片 杂 交 仪(M F S-8)5.6 尼 龙 转 印 膜(厚 度 6 m m 孔 径 0.4 5 m 负 电 荷)6 主 要 试 剂6.1 动 物 组 织 基 因 组 D N A 提 取 试 剂 盒。6.2 1 5 S S C 缓 冲 液。6.3 去 活 化 液(1 0 0 m m o l/L,N a O H)。6.4 去 活 化 清 洗 液(2 S S P E,0.1%S D S)。6.5 杂 交 清 洗 液(2 S S P E,0.5%S D S)。6.6 孵 育 液(碱 性 磷 酸 酶 标 记 的 链 霉 亲 和 素 按 1 2 0 0 0 的 比 例 加 入 孵 育 液 中)。6.7 孵 育 清 洗 液 1(2 S S P E,0.5%S D S)。6.8 孵 育 清 洗 液 2(0.3 m o l/L N a C l、2 0 m m o l/L N a H 2 P O 4、2 0 m m o l/E D T A N a 2,其 p H 为 7.4)。6.9 显 色 液(B C I P/N B T、5-溴-4-氯-3-吲 哚 磷 酸 和 氯 化 硝 基 四 氮 唑 兰)。6.1 0 P C R 引 物 及 探 针(引 物 浓 度 2 0 m o l/L、探 针 浓 度 5 m o l/L)。6.1 1 P C R M a s t e r B u f f e r(1 0 0 m m o l/L T r i s-H C l,1 5 m m o l/L M g C l 2,p H=8.0)。6.1 2 d N T P s(1 0 0 m o l/L)。6.1 3 T a q P o l y m e r a s e(0.0 5 U/L)。7 实 验 用 水实 验 用 水 符 合 G B/T 6 6 8 2-2 0 0 8 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 中 一 级 水 的 要 求。8 检 验 步 骤D B 5 1 3 2/T 8 8 2 0 2 338.1 P C R 引 物 及 探 针引 物 和 探 针 序 列 见 表 1。表 1 P C R 引 物 信 息物种 目的基因 引物/探针序列(5-3)内参 a c t i n 基因F:5-G A G C G C A A G T A C T C T G T G T G G A T-3 R:5-b i o t i n-A G A A G C A T T T G C G G T G G A C G-3 探针:5-A m i n o l i n k e r C 6-T C C A C C T T C C A G C A G A T G T G G A T C A-G C A A G C A G G A G T A-3 猪 C O X I 基因F:5-G C T T C A T C T T C C T A T T C A C C G T-3 R:5-b i o t i n-G T A A T A C A A T G T C T A G G G A G-3 探针:5-A m i n o l i n k e r C 6-T C C A C C T T C C A G C A G A T G T G G A T C A G C A A G C A G G A G T A-3 山羊 c y t b 基因F:5-T A T G C A T G T A G G A C G A G G C C T A T A-3 R:5-b i o t i n-A T T C A T T C G A C T A G G T T T G T G C C-3 探针:5-A m i n o l i n k e r C 6-T A C C A T G A G G A C A A A T A T C A T T-3 黄牛 1 2 S r R N AF:5-G T G A C A A A A A T T A A G C C A T A A A C G A-3 R:5-b i o t i n-T C A T G G C T T T T T A C A G C T T G G T-3 探针:5-A m i n o l i n k e r C 6-A A A G C A C C A T A C C A A A T A G G G T-3 水牛1 2 S r R N AF:5-G T G A C A A A A A T T A A G C C A T A A A C G A-3 R:5-b i o t i n-G C T G T T A T A G A G T C A C T T T C G T T G C-3 探针:5-A m i n o l i n k e r C 6-A A G C A C A C C G C T A A A T A G A G T T A-3 牦牛 1 2 S r R N AF:5-G A T A C C C C A C T A T G C T T A G C C-3 R:5-b i o t i n-A T T T C A T A A T A A C T T T C G T G C A-3 探针:5-A m i n o l i n k e r C 6-T A C A C T A A G A G A A C C A A T G C A-3 鸭1 2 S r R N AF:5-G A T A C C C C A C T A T G C T T A G C C-3 R:5-b i o t i n-A A G G G G C G G T T G G G T T G-3 探针:5-A m i n o l i n k e r C 6-C C T G T T C T G T A A T C G A C G A T C C A C G-3 狗 1 2 S r R N AF:5-G A T A C C C C A C T A T G C T T A G C C-3 R:5-b i o t i n-A C A T T C G T G A A A T G T T C T T G G-3 探针:5-A m i n o l i n k e r C 6-G T A A C T T A T G A G G T G G G A A G A A-3 兔 1 2 S r R N AF:5-G A T A C C C C A C T A T G C T T A G C C-3 R:5-b i o t i n-A C C T A A C G T T T T T A C G G T G G-3 探针:5-A m i n o l i n k e r C 6-A A C C C T A C C A C T C T T T G C C A A C T C A G C C-3 鸡1 2 S r R N AF:5-G A T A C C C C A C T A T G C T T A G C C-3 R:5-b i o t i n-G C T A T T G A G C T C A C T G T T G T T-3 探针:5-A m i n o l i n k e r C 6-C C A G C A C A G C C T A C A T A C C G C-3 D B 5 1 3 2/T 8 8 2 0 2 348.2 样 品 处 理 与 D N A 提 取抽 取 牦 牛 鲜 肉(牦 牛 肉 制 品)经 制 备 后,使 用 动 物 组 织 基 因 组 D N A 提 取 试 剂 盒 提 取 并 纯 化 D N A。8.2.1 D N A 浓 度按 G B/T 3 4 7 9 6 水 溶 液 中 核 酸 的 浓 度 和 纯 度 检 测 规 定 的 方 法 进 行,D N A 的 浓 度 1 0%。8.3 多 重 P C R 反 应 体 系以 8.2 中 提 取 并 纯 化 后 的 D N A 为 模 板,在 2 0 L 体 系 中 加 入 M i x 酶 1 0 L、正 向 引 物(2 0 m o l/L)0.5 L、反 向 引 物(2 0 m o l/L)0.5 L、模 板 D N A 1 0 0 n g、d d H 2 O 8 L,按 以 下 条 件 进 行扩 增:9 5 预 变 性 1 0 m i n;9 4 变 性 3 0 s、6 0 退 火 1 5 s、7 2 延 伸 1 5 s、3 3 个 循 环;7 2 延伸 3 m i n。得 到 扩 增 产 物。8.4 膜 芯 片 制 备将 尼 龙 转 印 膜 制 备 成 1.2 c m 1.8 c m 的 膜 条,将 裁 好 的 尼 龙 膜 放 置 于 双 蒸 水 中 浸 泡 1 5 m i n,再 用1 5 S S C 浸 泡 1 5 m i n,取 出 放 在 滤 纸 上 6 0 烘 干,待 尼 龙 膜 降 温 至 室 温,按 顺 序 加 入 内 参 探 针(5 m o l/L)、检 测 探 针(5 m o l/L)、阳 性 探 针 P C(5 m o l/L)以 及 阴 性 探 针 N C(5 m o l/L)(图 1)。图 1 芯 片 点 样 模 式 图8.5 杂 交 显 色1)P C R 产 物 变 性:P C R 产 物 9 5 5 m i n 使 其 解 链,放 置 冰 上 备 用。2)将 P C R 变 形 产 物 加 入 膜 芯 片 杂 交 仪 中,并 开 始 杂 交 程 序。3)膜 芯 片 去 活 化:将 制 备 好 的 膜 芯 片 放 入 杂 交 盒 内,芯 片 标 签 正 面 朝 上,加 入 1 m L 去 活化 液 3 7 孵 育 8 m i n。4)洗 膜:加 入 1 m L 去 活 化 清 洗 液 6 0 洗 脱 5 m i n。5)杂 交:将 变 性 后 的 P C R 产 物 与 1 m L 杂 交 液 充 分 混 匀,放 入 水 平 摇 床 4 5,9 0 r/m i n 孵育 4 5 m i n。D B 5 1 3 2/T 8 8 2 0 2 356)洗 膜:吸 除 杂 交 体 系 液,加 入 1 m L 预 热 好 的 杂 交 清 洗 液,水 平 摇 床 5 2,9 0 r/m i n,震 荡 清 洗 5 m i n,洗 涤 2 次。7)孵 育:吸 除 杂 交 清 洗 液,加 入 预 热 好 的 酶 孵 育 液,4 2 水 平 摇 床 9 0 r/m i n,震 荡 孵 育 3 0m i n。8)洗 膜:吸 除 酶 孵 育 液,加 入 1 m L 预 热 好 的 孵 育 清 洗 液 1,4 2 水 平 摇 床 9 0 r/m i n,震荡 清 洗 5 m i n,洗 涤 2 次;吸 除 孵 育 清 洗 液 1,加 入 1 m L 预 热 好 的 孵 育 清 洗 液 2,3 7 水 平 摇 床 9 0 r/m i n,震 荡 清 洗 5 m i n,洗 涤 2 次。9)显 色:吸 除 孵 育 清 洗 液 2,加 入 1 m L 显 色 液,3 7 静 置 1 5 m i n,吸 除 显 色 液,加 入 1 m L去 离 子 水 3 7 洗 涤 2 次,待 膜 芯 片 干 燥 后 进 行 结 果 判 读。具 体 流 程 如 表 2 所 示。表 2 杂 交 流 程 表程序名称 试剂名称 温度/时间/m i n去活化 去活化液 3 7 8去活化清洗 去活化清洗液 6 0 5杂交 杂交液 4 5 4 5杂交清洗 杂交清洗液 5 2 5杂交清洗 杂交清洗液 5 2 5酶孵育 孵育液 4 2 3 0孵育清洗 1 孵育清洗液 1 4 2 5孵育清洗 1 孵育清洗液 1 4 2 5孵育清洗 2 孵育清洗液 2 3 7 5孵育清洗 2 孵育清洗液 2 3 7 5显色 显色液 3 7 1 5显色清洗 去离子水 3 7 5显色清洗 去离子水 3 7 5结果判读 根据杂交点显色情况进行结果判读。8.6 结 果 判 读表 3 膜 芯 片 结 果 判 定结 果 类 型 内 参 基 因 P C N C 靶 基 因 结 果 判 定1-杂 交 失 败,重 复 试 验2-+-P C R 扩 增 失 败,重 复 试 验3+-样 品 中 不 含 本 标 准 中 9 中 动 物 源 性 成 分4+-+样 品 中 含 有 与 阳 性 信 号 点 对 应 的 动 物 源 性 成 分注:“+”为 阳 性,“-”为 阴 性。9 结 果 表 述9.1 牦 牛 点 显 色,表 述 为“检 出 牦 牛 成 分”;牦 牛 点 未 显 色,表 述 为“未 检 出 牦 牛 成 分”。9.2 牦 牛 点 与 其 他 靶 基 因 点 同 时 显 色,表 述 为“检 出 牦 牛 成 分,且 混 有 显 色 点 动 物 源 性 成 分”。D B 5 1 3 2/T 8 8 2 0 2 361 0 生 物 安 全 及 检 测 过 程 中 防 止 交 叉 污 染 的 措 施按 照 G B/T 2 7 4 0 3-2 0 0 8 实 验 室 质 量 控 制 规 范 食 品 分 子 生 物 学 检 测 的 规 定 执 行。D B 5 1 3 2/T 8 8 2 0 2 37参 考 文 献生 物 技 术 通 报 2 0 2 0.3 6(0 1):2 0 2 2 0 8 P C R 膜 芯 片 技 术 在 牦 牛 及 犏 牛 肉 制 品 的 真 假 鉴 定 中 的应 用_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
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