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I C S 6 5.0 2 0.2 0B 0 5黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 地 方 标 准DB23D B 2 3 0 8/T 1 8 2 2 0 2 3稻 瘟 病 菌 无 毒 基 因 检 测 P C R 法 技 术 规 范2 0 2 3-1 2-1 1 发 布 2 0 2 4-0 1-1 1 实 施佳 木 斯 市 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 2 3 0 8/T 1 8 2 2 0 2 3I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草。请 注 意 本 文 件 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利，本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 农 业 农 村 局 提 出 并 归 口。本 文 件 由 黑 龙 江 省 佳 木 斯 市 市 场 监 督 管 理 局 批 准 发 布。本 文 件 起 草 单 位：黑 龙 江 省 农 业 科 学 院 水 稻 研 究 所。本 文 件 主 要 起 草 人：陆 文 静、周 通、王 桂 玲、周 雪 松、韩 笑。本 文 件 2 0 2 3 年 首 次 发 布。D B 2 3 0 8/T 1 8 2 2 0 2 31稻 瘟 病 菌 无 毒 基 因 检 测 P C R 法 技 术 规 范1 范 围本 文 件 规 定 了 稻 瘟 病 菌（M a g n a p o r t h e g r i s e a）无 毒 基 因 检 测 P C R 法 技 术 规 范。包 括 分 子 检 测 原 理、仪 器 设 备、试 剂 及 样 品、防 污 染 措 施、实 验 步 骤 及 结 果 分 析。本 文 件 适 用 于 黑 龙 江 省 佳 木 斯 地 区 水 稻 稻 瘟 病 菌 无 毒 基 因 A V R-P i i、A V R-P i k、A V R-P i t a、A V R-P i z-t、A V R-P i a、A V R-C o 3 9 的 P C R 检 测。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的，凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。G B/T 6 6 8 2 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法G B/T 1 9 4 9 5.2 转 基 因 产 品 检 测 实 验 室 技 术 要 求3 术 语 和 缩 略 语下 列 术 语 和 缩 略 语 适 用 于 本 标 准。3.1 正 向 引 物：处 于 D N A 双 链 上 游 的 引 物，简 称 F 引 物。3.2 反 向 引 物：处 于 D N A 双 链 下 游 的 引 物，简 称 R 引 物。3.3 D N A：D e o x y r i b o n u c l e i c a c i d，脱 氧 核 糖 核 酸。3.4 P C R：P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n，聚 合 酶 链 式 反 应D B 2 3 0 8/T 1 8 2 2 0 2 323.5 G o l d e n v i e w：核 酸 染 料，替 代 溴 化 乙 锭。3.6 D N A M a r k e r：标 准 分 子 量 的 核 酸 标 记。4 原 理提 取 稻 瘟 病 菌 菌 丝 D N A，根 据 无 毒 基 因 保 守 区 域 序 列 设 计 特 异 性 引 物，对 样 品 进 行 P C R 扩 增，根 据 序 列 比 对 结 果，依 据 是 否 扩 增 得 到 预 期 的 D N A 片 段 大 小 的 序 列 来 判 断 样 品 是 否 携 带 该 无 毒 基 因。5 仪 器 设 备电 子 天 平、瓷 质 研 钵、研 杵、移 液 枪、水 浴 锅、高 速 离 心 机、核 酸 浓 度 测 定 仪（N a n o D r o p 2 0 0 0）、基 因 扩 增 仪、琼 脂 糖 电 泳 槽 及 电 泳 仪、凝 胶 成 像 系 统，其 它 相 关 仪 器 设 备。6 试 剂 及 样 品干 燥 的 稻 瘟 病 菌 丝 0.0 5 g 0.1 g、1 0%C T A B、5 M N a C l、0.5 M E D T A（p H 8.0）、1 M T r i s（p H8.0）、1 T E 缓 冲 液、氯 仿：异 戊 醇（2 4：1）、7 5%乙 醇、G o l d e n v i e w 等。除 非 另 有 说 明，仅 使 用 分 析 纯 试 剂 和 d d H 2 O 或 符 合 G B/T 6 6 8 2 规 定 的 一 级 水。7 实 验 过 程 防 污 染 措 施检 测 过 程 中 防 止 污 染 的 措 施 按 照 G B/T 1 9 4 9 5.2 中 的 规 定 执 行。8 实 验 步 骤8.1 稻 瘟 病 菌 菌 丝 D N A 提 取取 单 孢 培 养 后 烘 干 的 菌 丝 0.1 g 于 研 钵 中 加 入 液 氮 用 研 杵 研 磨，菌 粉 转 入 2 m L 灭 菌 离 心 管，并 加入 6 5 预 热 的 D N A 提 取 缓 冲 液 7 0 0 L，盖 盖 混 匀，置 于 水 浴 锅 内 6 5 温 浴 1 h（期 间 间 隔 1 5 m i n摇 动 混 匀，使 D N A 提 取 缓 冲 液 与 菌 丝 充 分 混 合，保 证 菌 丝 D N A 的 提 取 效 率）。1 2 0 0 0 r/m i n 离 心 1 0m i n，取 上 清 液 6 0 0 L 置 于 新 的 2 m L 离 心 管，加 入 等 体 积 氯 仿：异 戊 醇（2 4 1）振 荡 抽 提 5 m i n 1 0 m i n，1 2 0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n。缓 慢 吸 取 上 清 液 5 0 0 L 置 于 新 的 1.5 m L 离 心 管，加 入 等 体 积 氯 仿：异 戊 醇（2 4 1）振 荡 抽 提 5 m i n 1 0 m i n，1 2 0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n。缓 慢 吸 取 上 清 液 3 0 0 L 于 新 的1.5 m L 离 心 管，加 入 9 0 0 L、-2 0 预 冷 的 无 水 乙 醇，-2 0 放 置 1 0 m i n，1 2 0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n。D B 2 3 0 8/T 1 8 2 2 0 2 33倒 掉 上 清 液，用 7 5%乙 醇 洗 涤 沉 淀 3 次，干 燥 后 加 入 1 0 0 L 1 T E 缓 冲 液 溶 解，利 用 N a n o D r o p 2 0 0 0测 定 提 取 D N A 浓 度，并 用 1 T E 缓 冲 液 稀 释 至 1 0 0 n g/L，-2 0 保 存 备 用。8.2 P C R 反 应8.2.1 将 D N A、P r i m e S T A R B u f f e r（5）、d N T P M i x t u r e、正 向 引 物（F）及 反 向 引 物（R）及 d d H 2 O置 于 冰 上 融 化，引 物 序 列 参 考 附 录 A。8.2.2 在 0.2 m L 加 盖 无 菌 离 心 管 中，按 先 后 顺 序 加 入 以 下 试 剂：混 合 后 用 移 液 枪 抽 打 混 匀，封 盖 后 短 暂 离 心 待 用。8.2.3 将 离 心 管 置 于 P C R 仪 中，反 应 程 序 为：9 5 预 变 性 5 m i n，9 5 变 性 3 0 s，5 5 6 1 退火 3 0 s，7 2 延 伸 3 0 s 6 0 s（每 对 引 物 的 退 火 温 度 及 延 伸 时 间 参 见 附 录 A），2 9 个 循 环，7 2 总延 伸 5 m i n，4 保 存。8.3 电 泳用 2 0 0 m L 玻 璃 烧 杯 称 取 琼 脂 糖 0.5 g，加 入 0.5 T B E 缓 冲 液 5 0 m L。杯 口 用 锡 箔 纸 盖 好 封 严，置微 波 炉 中 加 热 至 琼 脂 糖 完 全 溶 解。待 琼 脂 糖 温 度 达 到 5 0 左 右 时 加 入 2.5 L G o l d e n v i e w，混 匀，迅 速将 胶 倒 至 模 具 中，放 上 样 梳。约 2 0 m i n 待 胶 完 全 凝 固 后，拔 下 上 样 梳，置 于 盛 有 0.5 T B E 缓 冲 液 的电 泳 槽 中。吸 取 5 L P C R 反 应 液，上 样 1 3 0 V，电 泳 0.5 h 1.0 h。电 泳 结 束 后，取 下 琼 脂 糖 凝 胶，利用 凝 胶 成 像 系 统 观 察 电 泳 条 带 大 小，照 相。8.4 P C R 产 物 测 序使 用 试 剂 盒 纯 化 2 5 L P C R 产 物，提 交 至 生 物 技 术 公 司 测 序。P r i m e S T A R B u f f e r（5）6 Ld N T P M i x t u r e（2.5 m M）2.4 L正 向 引 物 及 反 向 引 物（1 0 0 n M）0.2 L（终 浓 度：0.2 M 0.3 M）样 本 D N A 1 L（2 0-1 0 0 n g）d d H 2 O 2 0.1 LP r i m e S T A R H S D N A P o l y m e r a s e（2.5 U/L）0.3 LD B 2 3 0 8/T 1 8 2 2 0 2 349 结 果 分 析鉴 定 稻 瘟 病 菌 中 是 否 携 带 某 些 抗 稻 瘟 病 基 因 时，如 不 能 获 得 特 定 长 度 的 P C R 产 物，则 可 判 断 试 样中 不 含 有 相 应 的 无 毒 基 因；如 可 扩 增 出 特 定 长 度 的 P C R 产 物，则 需 结 合 电 泳 结 果 和 测 序 结 果 共 同 分 析。所 有 无 毒 基 因 的 扩 增 序 列 应 与 美 国 国 家 生 物 技 术 信 息 中 心（N C B I）数 据 库 中 对 应 序 列 相 比 对。附 录 A（规 范 性 附 录）用 于 扩 增 无 毒 基 因 的 引 物引 物 无 毒 基 因 引 物 序 列（5-3）延 伸 时 间（s）退 火 温 度（）P r i m e r 1 A v r 1-C o 3 9F C T C T G A A C A A C T A A G C A A C A4 0 5 5R C A A C C T G G A C T C T T A T T G A T CP r i m e r 2 A v r-P i aF T T A T T G C T A C C A C C T T C C T C3 0 5 5R G T A G T A A C T G A G T T G G C G T TP r i m e r 3 A v r-P i iF C C T C G G C T T C T T G T A T A T T A C T3 0 5 5R T A A A T C G T G C G C T T T C A G A TP r i m e r 4 A v r-P i kF C T G C A C A C A T C A A C A G T C T T3 0 5 6R T C A C A G T T A A G G C A A C G T A GP r i m e r 5A v r-P i t a 1*F G T T T C C G C C T T T A T T G G T T T5 0 5 6R A A T C C C A T C C C A T T C G T A A CP r i m e r 6A v r-P i t a 2*F T T C T C T A A C C T G C C A C G A T A3 0 5 5R C C T C C A T T C C A A C A C T A A C GP r i m e r 7 A v r-P i z-tF G A T C A A A T G A A C A C C A G G A A3 0 5 5R C G A T G A A G A A T G G A A G A A T G
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