鱼类粘孢子虫检测方法DB43／T 2816-2023.pdf

ICS 65.020.30 CCS B44 43 湖南省地方标准 DB 43/T 28162023 鱼类粘孢子虫检测方法 Detection methods of fish myxosporean 2023-11-09 发布 2024-02-09 实施 湖南省市场监督管理局 发 布 DB 43/T 28162023 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 试 剂与 材料.1 5 仪 器与 设备.1 6 采样.2 7 检查 步骤.2 8 结果 判定.3 附录A（规 范性）试剂 及其 配制.4 附录B（资 料性）不同 粘孢 子虫 感染 症状及 包 囊形 态.5 附录C（资 料性）几种 常见 粘孢 子虫 成熟孢 子 形态.6 DB 43/T 28162023 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.12020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标 准化 文件 的结 构和 起草 规则 的规定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能 涉及 专利。本 文件的 发布 机构 不承 担识 别专 利的 责任。本文件 由湖 南省 农业 农村 厅提 出。本文件 由湖 南省 农业 标准 化技 术委 员会 归口。本 文 件起 草单 位：湖南 农 业大 学、湖南 应用 技术学 院、资兴 市水 产良 种场、中国 科学 院 水生生 物研究所。本 文 件主 要起 草人：刘新 华、任 诗思、皮杰、李 德 亮、向建 国、余 建波、吕欣 荣、刘 志辉、叶 少 文。DB 43/T 28162023 1 鱼类粘孢子虫检测方法 1 范围 本文件 给出 了湖 泊鱼 类粘 孢子 虫检 测的 试剂 与材料、仪器 和设 备、采 样、检查 步骤 与结 果 判定方 法。本文件 适用 于鱼 类粘 孢子 虫的 检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的 规范 性引 用而 构成本 文件 必不 可少 的条 款。其 中，注日 期的 引用文 件，仅 该 日期 对应 的版 本适 用于 本文 件；不注 日期 的 引用 文件，其 最新 版本（包 括所 有的 修改 单）适用 于本文件。SC/T 7103 水 生动 物产 地检 疫采 样技 术规范 SC/T 7223.1 黏孢 子虫 病诊 断规 程 第1 部 分：洪 湖碘 泡虫 SC/T 7223.2 黏孢 子虫 病诊 断规 程 第2 部 分：吴 李碘 泡虫 SC/T 7223.3 黏孢 子虫 病诊 断规 程 第3 部 分：武 汉单 极虫 SC/T 7223.4 黏孢 子虫 病诊 断规 程 第4 部 分：吉 陶单 极虫 SN/T 2503 淡 水鱼 中寄 生虫 检疫 技术 规范 3 术语和 定义 本文件 没有 需要 界定 的术 语和 定义。4 试剂与 材料 本标准 所使 用的 试剂 均为 分析 纯，水为 蒸馏 水。乙醇：70%乙醇。溴酚蓝。10 xPCR Buffer MIX：-20 保 存，避免 反复 冻融。引物序 列 上游引 物：5-GAT TGA CGA GGT CGT TCG TTT A-3；下游引 物：5-AGT AGG CCC TTA CCC TAC TTA C-3；本对引 物扩 增小 核糖 体小 亚基rRNA 基 因（18S rDNA）的部 分序 列。DNA marker 2000（bp）:2000、1000、750、500、250、100。5 仪器与 设备 解剖盘、剪 刀、镊子、解 剖针、解 剖刀。体视显 微镜 和带 测微 标尺 的光 学显 微镜。盖玻片、载 玻片、培 养皿、巴 氏吸 管。恒温水 浴锅（控 温范 围：RT-100 1）。DB 43/T 28162023 2-20 和-80 冰 箱。微量移 液器（0.5 L 10 L，10 L 100 L，100 L 1000 L）。PCR 扩增 仪。离心管 和PCR 管。高压灭 菌锅。超净工 作台。水平电 泳系 统。紫外透 射仪 或凝 胶成 像系 统。6 采样 样品的 采集 应符 合SC/T 7103、SC/T 7223.1、SC/T 7223.2、SC/T 7223.3 和SC/T 7223.4 中 的相关要求，样 品封 存和 运输 应符 合SC/T 7103 的相关 规定。7 检查步 骤 目检 观察样 品，检查 顺序 应符 合SN/T 2503 中 的 相关要 求，先检 查体 表部 位是 否有 明显 的白 色包囊 或似包 囊 状瘤 状物，如体 表皮 肤、鳍、鼻腔、口腔、眼 球等，随后 解剖 鱼体 观察 内脏 是否 出现 白 色包 囊，包括体腔、脂 肪组 织、胃肠、肝、脾 等。镜检 7.2.1 当在7.1 中 发现 疑似 包囊 状物 时，用剪 刀与 镊子将 单个 或多 个包 囊分 离，置于 载玻 片上。然后，再用解 剖针 戳破 疑似 包囊 物，加入 约20 L-30 L 双 蒸水，盖 上盖 玻片 置于 光学 显微镜 中 观察 是否存在成 熟孢 子。7.2.2 当在鱼 体组 织中 未发现 疑似 包囊 状物 时，用 剪刀或 镊子 取少 量组织 或液 体（胆汁、血液、尿 液等）置 于载 玻片 上，用镊 子将 组织 分散，加 入约20 L-30 L 双蒸 水，盖上 盖玻 片，稍加 压平，置于光学 显微 镜中 观察 是否 存在 成熟 孢子。分子鉴 定 7.3.1 检测样 本固 定 将6.2 中粘 孢子 虫感 染的 包囊 或组 织从 宿主 上分离，用浓 度大 于70%的乙 醇固 定于 离心 管中（参 见附录A），低温（-20）保存，标 识好 标签 并记录。7.3.2 DNA 提取 将6.2 固 定的 样品 充分 混匀，破碎 后用 磷酸盐 缓 冲液 洗涤 两次 以去 除残 余酒 精。将 离心管 置 于-80 冰箱快 速冷 冻5 min，取 出并 立即 置于80 水 浴 锅中5 min，重 复三 次后 镜检 观察 孢子是 否 完全 破碎，极丝是 否挤 出。破碎 后利 用细 胞/组织 基因组 DNA 提 取试 剂盒，提 取样 品基 因组 DNA。提取好 的基 因组DNA 置于-20 保 存备 用。7.3.3 PCR 扩增 DB 43/T 28162023 3 在 50 L 的 PCR 反应 体系 中，包含 模板 基因 组DNA 2 L、10PCR Buffer MIX（康 为世纪）25 L、上 游引 物和 下游 引物（10 M/L）各 2 L、加 双蒸 水定 容至50 L。在PCR 扩 增仪 中，反应 程序 为94 预 变性 4 min；94 变性 1 min；46 退 火50s；65 延伸 1 min,35 个循 环；65 终 延伸 10 min。PCR 扩 增时，应 设置 阴性 对照 和阳 性对 照。7.3.4 PCR 产 物电 泳与 测序 取5 微升PCR 扩 增产 物，用添 加溴 酚蓝 指示 剂的1.0%琼脂 糖凝 胶于 TAE 缓冲 液（参见 附录 A）中 电泳 分 离，同时 设置DNA 分 子量 标准 作参 照，紫外透 射仪 下检 查是 否存 在大 约900bp 的目 的条带。如果 存在，则 取PCR 扩增 产物 测序，测 序后 通过GenBank 进行BLAST 比 对。8 结果判 定 目检 当肉眼 观察 到明 显白 色包 囊或 白色 囊状 物（见附录B），可 以怀 疑为 粘孢 子虫 感染，但需 经 8.2、8.3 步 骤检 查后 才能 进一 步确 诊。镜检 8.2.1 将经8.1 步骤 检查 未观 察到 明显 包囊 的组 织进 一 步置 于解 剖镜 下，观察 是否 有肉 眼不 可见 的白色包囊（见附 录B），如观 察到 需将 其从 组 织中分 离，并经7.2.2 进行 观察 后确 诊。8.2.2 将经8.1 和 8.2.1 步骤 观察 的疑 似包 囊以 及外 观 正常 的少 量组 织进 行压 片，观察 到明 显的 粘孢子虫成 熟孢 子即 可确 诊（见 附录C）。分子鉴 定 将所测 定的 18S rDNA 序列（900 bp 左 右）与 GenBank 数据 库中 粘孢 子虫 序列 进行 比对，如比 对出来的种 类均 为粘 孢子 虫序 列相 似性 在80%以上，亦可 判定 为粘 孢子 虫。DB 43/T 28162023 4 A A 附录A（规范 性）试剂及 其配 制 A.1 70%乙醇 溶液 70 mL 无水 乙醇 溶液，加30mL PBS 缓 冲液（0.01 mol/L,pH7.4）。A.2 磷酸盐 缓冲 液（0.01 mol/L,pH7.4）称 7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4（or 1.44g Na2HPO4）和 1.8g K2HPO4，溶 于 800 ml 蒸 馏水中，用HCl 调 节溶 液的pH 值至7.4，最 后加 双蒸水 定容 至1 L，4 冰 箱保 存。A.3 TAE 电泳 缓冲 液（50 倍）称量242.0 g Tris 碱、37.2 g Na2EDTA2H2O 混合，然 后加 入800 mL 的去 离子 水充 分搅 拌 溶解，再加入57.1ml 的冰 乙酸，充 分混 匀，加去离 子 水定 容至1L，室 温保 存。A.4 溴酚蓝 指示 剂溶 液 取溴酚 蓝 100 mg，加 双蒸 水 5 mL,在室 温下 过夜，待溶 解后 再称 取蔗 糖 25 g，加 双蒸 水溶 解 后移入溴酚 蓝溶 液中，摇 匀后 加双 蒸水 定容 至50 mL，加 入氢 氧化 钠（NaOH）溶液 1 滴，调至 蓝 色。DB 43/T 28162023 5 B B 附录B（资料 性）不同粘 孢子 虫感 染症 状及 包囊 形态 图B.1 不同 粘孢 子虫 病感 染症 状(A)：普洛 宁碘 泡虫 感染 鲫鱼 腹腔 症状，靶尺=1 cm；(B)：吉陶 单极 虫感 染散 鳞镜 鲤皮 肤症 状，靶 尺=5 cm；(C)：米 氏碘 泡虫 感染 鲶肠 道症 状，靶尺=5 cm；(D)：九州 碘泡 虫感 染鳙 鱼皮 肤，靶尺=5 mm；(E)：汪氏 单极 虫感 染异 育银 鲫鳃 症状，靶尺=0.5 cm；(F)：基部 碘泡 虫感 染拟 鲤鳃 基部 症状，靶尺=500 m。DB 43/T 28162023 6 C C 附录C（资料 性）几种常 见粘 孢子 虫成 熟孢 子形 态 图C.1 不同 粘孢 子虫 孢子 形态(A)：巨间 碘泡 虫，靶尺=20 m；(B)：帕夫 洛斯 碘泡 虫，靶尺=20 m；(C)：多 涅茨 尾孢 虫，靶尺=10 m；(D)：武汉 单极 虫，靶尺=5 m。