粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的PCR检测DB22／T 1821-2013.pdf

ICS 67.050 X 04 备案号：37940-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1821 2013 粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的 PCR检测 Detection of trichothecenes-producing fungi in grains by PCR method 2013-05-15发布 2013-09-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1821 2013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、华蕾、刘金华、王莹、李媛媛、初真林、王伟、刘静秋、周亮、王潇、刘晓晖、王颖、任明月。DB22/T 1821 2013 1 粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的 PCR检测 1 范围 本标准规定了粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的 PCR检验方法。本标准适用于粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的快速筛选。2 规范性引用文件 下 列文件对 于本 文件 的 应 用 是必不可少 的。凡是注日期 的 引 用 文件，仅所注日期 的 版 本适用于本 文 件。凡是不注日期 的 引 用 文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本 文件。GB 4789.15 食品 微生 物 学 检验 霉菌和 酵母计数 GB/T 6682 分析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法 GB 19489 实 验 室 生 物 安全通 用要 求 WS/T 230 临床诊断 中 聚 合 酶链式反应（PCR）技术的 应 用 3 原理 单端孢霉烯 前体（trichodiene）合 成酶是催 化 所有 真菌单端孢霉烯族化合物合 成反应第一步 的 酶类。根据该生 化合 成过程 中的 关键基因：单端孢霉烯 前体 合 成酶编码基因 tri5的 有无来判断待 检 样 品 是否污 染 了产单端孢霉烯族化合物的真菌。4 试剂和材料 除特别说 明 以外，所 用 试剂为分析纯或生 化 试剂。4.1 水：应符 合 GB/T 6682中 一级水 的规 格。4.2 马 铃薯-葡萄糖-琼脂（Potato dextrose agar，PDA）：按 GB 4789.15规定。4.3 CTAB缓冲液：55 mmol/L CTAB、1 400 mmol/L氯 化 钠（NaCl）、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L Tris，用 10%盐酸（HCl）调 pH至 8.0，121 高压灭 菌 20 min，储存 于 2 8。4.4 TE缓冲液：10 mmol/L Tris、150 mmol/L氯 化 钠（NaCl）、2 mmol/L EDTA、1%十二烷 基 磺酸钠，用 10%盐酸（HCl）调 pH至 8.0，121 高压灭 菌 20 min，储存 于 2 8 备 用。4.5 RNA 酶 溶液（5 g/L）。4.6 蛋白 酶 K（20 mg/mL)。4.7 Tris饱 和 酚。4.8 酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）；三氯甲烷：异戊醇（24：1）。4.9 异丙醇。4.10 70%乙醇。4.11 10 PCR缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L氯 化 钾，15 mmol/L氯 化 镁。4.12 引 物 上游：5-GGGATGCTGGATTGAGCAG-3 下 游：5-CATCACCTGAGGGTCCTTGT-3 DB22/T 1821 2013 2 4.13 Taq DNA聚 合 酶。4.14 dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。4.15 分 子 量标 记：100 bp DNA Marker。4.16 50 TAE电泳缓冲液：称取 484 g Tris，量 取 114mL冰醋酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA，溶 于 水 中，定 容至 2 L。分 装后高压灭 菌 备 用。使 用 前 稀释 成 1 TAE电泳缓冲液（工作液）。4.17 6 加 样 缓冲液：30 mmol/L EDTA、36%（体 积 分数）甘油、0.05%（质量 浓度）二甲苯腈蓝 FF、0.05%(质量 浓度)溴酚蓝。4.18 琼脂糖：电泳 纯。4.19 阳性 质 控 菌 株：来 源 于 正 规菌 种保藏机构 的 禾谷镰刀 菌标准菌 株。4.20 阴性 质 控 菌 株：来 源 于 正 规菌 种保藏机构 的 非目 标菌 株。5 仪器和设备 5.1 天平：感 量 0.001 g。5.2 生 物 安全 柜：AII型。5.3 霉菌 培养箱：28 1。5.4 高压灭 菌 器。5.5 恒温 水 浴锅：65 1。5.6 高 速 冷冻离心 机：转 速 不 低 于 12 000 r/min。5.7 PCR仪。5.8 核 酸电泳 仪。5.9 凝胶 成 像 分析 系统。5.10 紫 外分 光光 度 计。5.11 涡旋混 合 器 5.12 微 量 移 液 器：0.2 L 2 L、2 L10 L、20 L200 L、100 L1 000 L。5.13 离心管：1.5 mL。6 生物安全措施 为 了 保 护 实 验 室 人 员 的 安全，应 由 具 备 资 格 的 工作 人 员 检 测 真菌，所有 培养 物 应 小心处置。应 按照 GB 19489的规定 执行。7 废弃物处理和防止污染的措施 7.1 检验 过程 中的 废弃 物 需经 121 高压灭 菌 处理 至 少 30 min后 再弃置。7.2 检验 过程 中 防止交叉 污染 的 措施 按 WS/T 230执行。8 检测 8.1 样品制备与培养 参 照 GB 4789.15对样 品 进行 稀释 与 培养。8.2 DNA提取 8.2.1 DNA模板制备 从 培养平 皿 上 刮 取 菌 丝 0.2 g 0.5 g于 1.5mL 离心管，加 入 少 许石英砂 用 细玻璃棒充 分 碾碎 菌 丝，加 入 500 L CTAB、40 L蛋白 酶 K，震荡均匀，65 水 浴 30 min；加 入 500 L酚：三氯甲烷：异戊DB22/T 1821 2013 3 醇(25：24 1)，强烈震荡，12 000 r/min 离心 15 min；吸 取上 层 水 相 至 1.5 mL离心管 中，加 入 等 体 积 的 异丙醇，震荡混匀，1 2000 r/min离心 10 min；弃 上 清 液，用 预热 至 65 TE缓冲液溶 解 DNA（TE量 视 DNA沉淀 的 多 少 而 定）；加 入 5 LRNA 酶 溶液，37 水 浴 30 min；加 入 200 L三氯甲烷：异 戊醇(24 1)，强烈震荡，12 000 r/min 离心 15 min；吸 取上 层 水 相 至 新 的 1.5 mL 离心管 中，加 入 等 体 积 的 异丙醇，震荡均匀，1 2000 r/min 离心 10 min；弃 上 清 液，加 入 1mL70%冰乙醇 洗涤沉淀 DNA，12 000 r/min 离心 1 min；弃 上 清 液，无 菌 条 件 下 自然干燥，加 预热 至 65 TE缓冲液溶 解 DNA。（如不 能及时 检验，可 将 提 取液 于-20 保存）。也 可 使 用 等 效 的真菌 基因 组 DNA提 取 试剂 盒。8.2.2 DNA浓度测定 采 用 紫 外分 光光 度 法 测 定 DNA，所 测 得 OD值 为 核 酸 总 量。紫 外分 光光 度 法检 测核 酸浓度 的 最 佳范围 是 2 g/mL50 g/mL，值 应该 在 0.051的 区间内。将 DNA溶液 做 适 当 的 稀释，放 入 紫 外分 光光 度 计 的 比色 皿 中，于 260 nm处测 定 其 吸 收值，1 OD260nm=50 g/mL双 链 DNA或 38 g/mL单 链 DNA。PCR级 DNA溶液 的 OD260nm/OD280nm比值 为 1.72.0。8.3 PCR 检 测 8.3.1 空白对照、阴性对照和阳性对照试验 检验 过程 中 分别 设空 白 对 照、阴性 对 照、阳性 对 照。空 白 对 照 设 为以水 代替 DNA模板；阴性 对 照 采 用 非目 标菌的 DNA作 为 PCR反应 的 模板；阳性 对 照 采 用 禾谷镰刀 菌 DNA作 为 PCR反应 的 模板。8.3.2 反应体系 表 1 PCR反应体系 试 剂 加 入量（L）10 PCR buffer 2.5 dNTP溶液(10 mmol/L)0.5 Taq DNA聚 合 酶(5 U/L)0.2 上游 引 物(10 mol/L)1.0 下 游 引 物(10 mol/L)1.0 DNA模板（100 ng/L)2.0 补 水 至 25 8.3.3 PCR扩增条 件 94 预 变 性 5 min，94 变 性 1 min，55 退火 50 s，72 延伸 1 min，34个循环，72 后 延伸 10 min，结束 反应，4 保存。扩增片段长 度：379 bp。不 同 仪器、不 同 Taq DNA聚 合 酶可根据 要 求 将 反应 条 件 做 适 当 调 整。8.3.4 凝胶电泳 检测 PCR产物 用 电泳缓冲液（1 TAE）制 备 2%琼脂糖 凝胶（55 60 时 加 入 溴 化 乙 锭 至 终 浓度 为 0.5 g/mL，也 可 在 电泳后 进行 染 色）。取 8 L15 L PCR扩增 产物，分别 和 2 L上 样 缓冲液 混 合，进行 点 样，用 DNA Ladder作 参 照。9 V/cm恒 压电泳，电泳 40 min60 min，电泳 检 测 结果 用 凝胶 成 像 分析 系统 记 录 并 保存。9 结果描述 与 判 定 在 阴性 对 照 未 出 现 条 带，阳性 对 照出 现 预 期 379 bp的 扩增 条 带 条 件 下，如测 试样 品 未 出 现 379 bp的扩增 条 带，则 表示 样 品中 无 产单端孢霉烯族化合物真菌 核 酸；如测 试样 品出 现 379 bp扩增 条 带 则 表示 样DB22/T 1821 2013 4 品中 存 在 产单端孢霉烯族化合物真菌 核 酸。_