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ICS 62.120 B 20 备案号：33839-2012 DB42 湖北省 地 方 标 准 DB42/T 808 2012 饲料中黄 曲霉毒素B1、玉米 赤霉烯酮、赭曲霉毒 素 A 和桔霉素的测 定 高效液相 色谱法 Determination of aflatoxin B1,zearalenone,ochratoxin A and citrinin in feed-HPLC method 2012-03-01 发布 2012-05-01 实施 湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB42/T 8082012 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 原理.1 4 试 剂与 材料.1 5 仪 器与 设备.2 6 采样.3 7 试 样制 备.3 8 分 析步 骤.3 8.1 提取 与净 化.3 8.2 测定.3 附录 A（资料 性附 录）标准工 作液 色谱 图（四通 道）.5 图 A.1 黄曲 霉毒 素 B1 标 准工作 液的 色谱 图.5 图 A.2 玉米 赤霉 烯酮 标 准工作 液的 色谱 图.5 图 A.3 赭曲 霉毒 素标 准 工作液 的色 谱图.5 图 A.4 桔霉 素标 准工 作 液的色 谱图.5 附录 B（资料 性附 录）标准工 作液 色谱 图（程序 波长）.6 图 B.1 黄曲 霉毒 素 B1，玉米赤 霉烯 酮，赭曲 霉毒 素和桔 霉素 标准 工作 液的 色谱图.6 DB42/T 8082012 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利，本文 件的 发布机 构不 承担 识别 这些 专利的 责任。本标准 由湖 北省 农业 科学 院 提出 并归 口。本标准 起草 单位：湖北 省 农业科 学院 农业 质量 标准 与检测 技术 研究 所、华 中 农业大 学、重 庆市 畜牧科学院。本标准 主要 起草 人：胡定 金、周有祥、彭祥伟、李书 谦、王小红、陈建彪、路 磊、董丽娜、夏 虹、解华东。DB42/T 8082012 1 饲 料中黄 曲霉毒素 B1、玉米赤 霉烯 酮、赭曲霉 毒素 A 和桔 霉素的测定 高 效液相 色谱法 1 范围 本标准 规定 了饲 料中 黄曲 霉毒素B1、玉 米赤 霉烯 酮、赭 曲霉 毒素A 和 桔霉 素的 高效液 相色 谱测 定 的原理、试剂 与材 料、仪器 与设备、采 样、试验 制备 及分析 步骤。本标准 适用 于 湖 北省 畜禽 配合饲 料、饲 用谷 物原 料 中黄曲 霉毒 素B1、玉米 赤 霉烯酮、赭曲 霉毒 素A和桔霉 素 的 测定。本标准的方法检测限：黄曲霉毒素B1 为8 g/kg，玉 米 赤 霉 烯 酮 为260 g/kg，赭曲霉毒素A 为10 g/kg，桔 霉素 为25 g/kg。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分析 实验 室用 水规格 和试 验方 法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动 物饲料 试 样的制 备 3 原理 试样中 的黄 曲霉 毒素B1、玉米赤 霉烯 酮、赭曲 霉毒 素A和 桔霉 素，经乙 腈-水 酸性溶 液提 取，浓 缩 至干，以 正己 烷除 杂，乙 腈定 容，通 过带 有荧 光检 测器 的液相 色谱 系统 分析，保 留时间 定性，外 标法 定 量。4 试剂与 材料 除非另 有说 明，在分 析中 仅使用 确认 为分 析纯 的试 剂和GB/T 6682 中 规定 的二 级水。4.1 乙腈：色谱 纯。4.2 磷酸：85%（质 量分 数）。4.3 冰乙酸。4.4 正己烷。4.5 无水硫 酸镁。4.6 氯化钠。4.7 次氯酸 钠：化学 纯。4.8 黄曲霉 毒 素 B1 标 准品：纯 度98%。4.9 玉米赤 霉烯 酮 标 准品：纯 度98%。4.10 赭曲霉 毒 素 A 标 准品：纯 度98%。4.11 桔霉素 标准 品：纯度 98%。DB42/T 8082012 2 4.12 黄曲霉 毒 素 B1 标准 储 备溶 液：准确 称取 适量 的黄 曲 霉毒 素 B1 标 准品（4.8），用 乙腈（4.1）配制成 1.0 10-2 g/L 的黄曲霉 毒素 B1 标准 储备 液，避光 保存 于 4 冰箱 备用。4.13 玉米赤 霉烯 酮标 准储 备溶 液：准 确称 取适 量的 玉米 赤霉烯 酮标 准品（4.9），用乙腈（4.1）配制成 5.0 10-2 g/L 的玉米赤 霉 烯酮标 准储 备液，避 光保 存于 4 冰 箱备 用。4.14 赭曲霉 毒 素 A：准确 称取 适量的 赭曲 霉毒 素 A 标 准 品（4.10），用 乙腈（4.1）配制 成 1.0 10-2 g/L的赭曲 霉毒 素 A 标准储 备 液，避 光保 存 于 4 冰箱 备用。4.15 桔霉素 标准 储备 液：准确 称取适 量 的 桔霉 素标 准品（4.11），用乙 腈（4.1）配制 成 5.0 10-2 g/L的桔霉 素标 准储 备液，避 光保存 于 4 冰 箱备 用。4.16 混合标 准溶 液工 作液 取适量 四种 标准 储备 液至10 mL 容量瓶（5.8）中，加 乙腈（4.1）稀 释至 刻度，现配现 用，按 照表1规定进 行。表1 真 菌毒 素混 合标 准溶 液（单位 为克每 升）项目名称 标准溶 液1 标准溶 液2 标准溶 液3 标准溶 液4 标准溶 液5 黄曲霉 毒 素B1 5.0 10-5 1.0 10-4 1.5 10-4 2.0 10-4 4.0 10-4 玉米赤 霉烯 酮 5.0 10-4 1.0 10-3 1.5 10-3 2.0 10-3 4.0 10-3 赭曲霉 毒 素A 5.0 10-5 1.0 10-4 1.5 10-4 2.0 10-4 4.0 10-4 桔霉素 2.5 10-4 5.0 10-4 7.5 10-4 1.0 10-3 2.0 10-3 注1：如需单独检测，可使用表 1 中 的单一标准溶液。注2：黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素 A 和桔霉素是有 毒有害物质，测定时应特别注 意安全防护。测 定应在通风橱或者生物安全柜中进行并戴手套，尽量减少暴露。凡是接 触过毒素的物品，应用次 氯酸钠溶液（4.20）浸泡 1 小时以上；如皮肤接触 到毒素，应 立即用次氯酸钠溶液清洗，再用自来水冲洗。4.17 酸性提 取液 吸取12 mL 冰乙酸（4.3），以水 定容 至100 mL，摇匀待用。4.18 流动 相 A 取 5 mL 磷酸（4.2）加入 1 000 mL 水中。临用 前，过 0.45 m 滤膜（5.12）。4.19 流动 相 B 色谱纯 乙腈（4.1）。4.20 次氯酸 钠溶 液 称取 106 g 次氯 酸钠（4.7）溶解 于 1 000 mL 水中，其中有 效氯 含量 不低 于 5%。5 仪器 与 设备 5.1 分析 天 平，感 量 0.000 1 g。5.2 分样筛：孔径 0.45 mm。5.3 粉碎机。5.4 漩涡混 合器。5.5 摇床。5.6 旋转蒸 发仪。5.7 1 mL 可调移液 器。5.8 10 mL 棕色容量 瓶。5.9 250 mL 圆底磨口 烧瓶。5.10 50 mL 具塞 PVC 离心 管。DB42/T 8082012 3 5.11 2 mL 带盖 PVC 离 心管。5.12 0.45 m 微孔 滤膜（适 用于 水溶剂）。5.13 0.45 m 微孔 滤膜（适 用于 有机溶 剂）。5.14 离心机，配 有 50 mL 离心管适配 器，最大 转速 为 4 000 r/min。5.15 氮吹仪。5.16 高效液 相色 谱仪，配 有荧 光检测 器。6 采样 按照GB/T 14699.1 的规 定 执行。7 试样制 备 按照GB/T 20195 制备试 样，磨碎 样品 并全 部通 过分 样筛（5.2），充分 混匀，避光保 存备 用。8 分析步 骤 8.1 提取与 净化 8.1.1 试样提 取 称取10 g 试 样（精确 至0.000 1 g），分装 于2 个50 mL 离 心管（5.10）中，各加入15 mL 酸性提取液（4.17），旋紧管 盖，在漩 涡混 合器（5.4）上 剧 烈振 荡2 min，置于摇 床（5.5）振摇20 min。取出 离心 管，各管 添加20 mL 乙腈（4.1），再次 振摇20 min，依 次加 入2 g 氯 化钠（4.6）和 3 g 无水硫 酸镁（4.5），迅 速旋紧管 盖，在 漩涡 混合 器（5.4）上 剧烈 振荡2 min，以3 500 r/min 离心10 min，促 使乙 腈相 和水 相 分 层，并用移液器（5.7）取出各 管中的上层 乙腈层，合并 于250 mL 圆底 磨口烧瓶（5.10）中（操作 时注意不要取到 水相）。残留 液再 用15 mL 乙腈（4.1）重复 提取一 次，合并 后，即为 样品提 取液。8.1.2 试样浓 缩和 净化 将 上述 样品 提取 液置于40 下减 压浓 缩至 干，加 入4 mL 正己烷（4.4）和1 mL 乙腈（4.1）充 分洗 涤残渣，静置分层后，用移 液器（5.7）取出上 层正己 烷，弃去。收集乙 腈 提取 液于2 mL 离心管（5.11）中，并 用少 量乙 腈（4.1）重复洗 涤残 渣后，合 并乙 腈 提取 液，氮吹 至近 干，用乙腈（4.1）准确 定容 至1 mL，在漩涡混合 器（5.4）上混匀 后，用0.45 m 微 孔滤膜（5.13）过滤，待 测。8.2 测定 8.2.1 液相色 谱参 考条 件 色谱柱：C18色谱 柱（长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 m）或相当者，推 荐使 用Inertsil ODS-3（cat.NO 5020-04646）1)；柱 温：30；流 速：0.8 mL/min；进样量：40 L；流动相：流 动相A+流动 相B（50+50），体 积比；检测器 条件：荧 光检 测器。1)色谱柱是由岛津-GL(上海)商贸 有限公司提供的产品。给出这一信息是为了方便标准的使用者，并不代表对该产品的认可。如果其他产品能有相同的效果，则可使用这些等效的产品。DB42/T 8082012 4 多通道 荧光 检测 器检 测 参 数如下：黄 曲霉 毒 素B1：激 发波 长（Ex）=360 nm，发射 波 长（Em）=440 nm；玉米赤 霉烯 酮：激发 波长（Ex）=274 nm，发射 波 长（Em）=440 nm；赭曲霉 毒素A：激 发波 长（Ex）=333 nm，发射 波 长（Em）=477 nm；桔霉素：激 发波 长（Ex）=330 nm，发 射波 长（Em）=500 nm。荧光检 测器 程序 波长 参数 如下：0 10 min：激发 波长（Ex）=360 nm，发 射波 长（Em）=440 nm；1017 min：激发 波长（Ex）=330 nm，发 射波 长（Em）=500 nm；1719 min：激发 波长（Ex）=333 nm，发 射波 长（Em）=477 nm；1925 min：激发 波长（Ex）=274 nm，发 射波 长（Em）=440 nm。8.2.2 标准曲 线的 绘制 向基线平稳的液相色谱分 析仪连续注入各浓度 混合 标准工作溶液，浓度由高 到低，以峰面积-浓度作图，建立 工作 曲线。8.2.3 定量测 定 注入待 测样 液，各待 测物 的峰面 积响 应值 应在 标准 曲线线 性范 围内，超 过线 性范围 则应 稀释 后 再 进行 分析。依 据峰 面积，从标 准曲 线中 得到 待测 样液中 待测 物的 浓度（C），附 录A 和附 录B 给 出了 相关色谱图。8.2.4 结果计 算 按式（1）计算 试样 中检 测 目标物 的含 量（g/kg）：000 1000 1mV CX.(1)式中：X 试 样中 检测目 标物 的 含量，以质 量分 数表 示，单位为 微克 每千 克（g/kg）；C 由 标准 曲线 计算 得到 的上机 试样 溶液 中目 标物 浓度，单位 为纳 克每 毫升（ng/mL）；V 浓 缩至 干后试 样的 定 容体积，单 位为 毫升（mL）；m 试 样的 质量，单 位 为克（g）。平行测 定结 果用 算术 平均 值表示，保 留三 位有 效数 字。8.2.5 精密度 同一实 验室 由同 一操 作人 员使用 同一 仪器 完成 的两 个平行 测定 结果 的相 对偏 差不大 于15%。DB42/T 8082012 5 A A 附 录 A（资料 性附 录）黄曲霉 毒 素B1、桔 霉素、赭曲霉 毒 素 A 和 玉米 赤霉 烯酮色 谱图（四 通道 荧光 检测器）图 A.1 黄曲 霉毒 素 B1 标 准工作 液的 色谱 图（激发 波长=360 nm,发射 波长=440 nm,0.5 ng）图 A.2 玉米 赤霉 烯酮标 准 工作液 的色 谱图（激 发波 长=274 nm,发 射波 长=440 nm,125 ng）图 A.3 赭曲 霉毒 素 A 标 准 工作液 的色 谱图（激 发波 长=333 nm,发 射波 长=477 nm,0.5 ng）图 A.4 桔霉 素 标 准工作 液 的色谱 图（激发 波长=330 nm,发射波 长=500 nm,12.5 ng）DB42/T 8082012 6 B B 附 录 B（资料 性附 录）黄曲霉 毒 素B1、玉 米赤 霉 烯酮、赭曲 霉毒 素 A 和桔 霉素色 谱图（程 序波 长荧 光检测 器）分钟 图B.1 黄 曲霉 毒素B1（AFB1），玉米 赤霉 烯酮（ZEN），赭曲 霉毒 素（OTA）和桔霉 素（CIT）标准工 作液 的色 谱图 荧光检 测器 程序 波长 参数 如下：0 10 min：激发波 长（Ex）=360 nm，发射 波长（Em）=440 nm；1017 min：激发波 长（Ex）=330 nm，发射 波长（Em）=500 nm；1719 min：激发波 长（Ex）=333 nm，发射 波长（Em）=477 nm；1925 min：激发波 长（Ex）=274 nm，发射 波长（Em）=440 nm。_
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