动物源性饲料中猪源性成分测定 实时荧光PCR方法DB22／T 2050-2014.pdf

ICS 65.120 B 46 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 2050 2014 动物源性饲料中猪源性成分测定 实时荧光 PCR方法 Determination of porcine derived materials in animal-originated feedstuffs Real-time PCR method 2014-02-28发布 2014-04-30实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2050 2014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、华蕾、王潇、亓晓艳、王颖、冷喜芳、吴桐、陈颖。DB22/T 2050 2014 1 动物源性饲料中猪源性成分测定 实时荧光 PCR方法 1 范围 本标准规定了动物源性饲料中猪源性成分的实时荧光 PCR检验方法，该方法的检出限为 0.1%。本标准适用 于 动物源性饲料中猪源性成分的定性检 测。2 规范性引用文件 下列文件对于 本 文件 的 应 用 是必不可少 的。凡是注日期 的 引 用 文件，仅所注日期 的 版 本适用 于 本 文 件。凡是不注日期 的 引 用 文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用 于 本 文件。GB/T 6682 分 析 实验 室 用 水 规 格 和 试 验方法 GB/T 27403 实验 室 质量 控制 规 范 食 品分 子生 物 学 检 测 3 术语和定义 下列 术 语 和定 义 适用 于 本 文件。3.1 猪源性成分 porcine-derived materials 猪 种属特异 性 DNA片段。3.2 实时荧光 PCR real time PCR 实时荧光 聚合酶链式反应。3.3 Ct值 cycle threshold value 每个反应管内 的荧光 信号达到设 定的 阈值 时 所经历 的 循环数。4 原理 对样 品 进行 DNA提 取，通过 实时荧光 PCR扩增，观察 实时荧光 PCR的 增幅曲线，检 测 饲料中猪源性 成分。5 试剂 除特别说明以外，所有试剂均 为分 析纯，水 为按照 GB/T 6682规定的 一 级 水。所有试剂均 用 无 DNA酶 污染 的 容器 分 装。DB22/T 2050 2014 2 5.1 引 物和 探针 a)上游 引 物：5-CATGCGTATCACCACCATTATATC-3 b)下 游 引 物：5-TGCCAAGCGGGTTGCT-3 c)探针：FAM-CGAGCTTAACTACCATGCCGCGTGA TAMRA 5.2 Taq DNA聚合酶。5.3 dNTP：dATP（deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。5.4 动物 基因组 DNA提 取纯 化 试剂 盒。5.5 RNase A酶：冻干 品，不 含 DNase。5.6 蛋白 酶 K：冻干 品。5.7 75%乙醇、异 丙醇、三氯甲烷、异 戊醇、正己烷等 有 机 试剂。5.8 Tris饱 和 苯酚。5.9 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。5.10 三 水合 乙酸钠、氯化钠。5.11 十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide，CTAB）。5.12 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2 2H2O）。5.13 10 PCR缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L氯化钾（KCl），15 mmol/L氯化镁（MgCl2）。5.14 RNase A酶 溶液：用 高压灭菌 的 去离 子水 溶解 RNase A酶 为 10 g/L的 溶液，分 装后 于-20 保存，避免 反 复冻融。5.15 蛋白 酶 K溶液：用 高压灭菌 的 去离 子水 溶解蛋白 酶 K为 20 mg/mL的 溶液，分 装后 于-20 保存，避免 反 复冻融。5.16 乙酸钠溶液，3 mol/L：在 80 mL水 中，加入 40.81 g三 水合 乙酸钠，溶解后 用 冰乙酸调节 pH值到 5.2，用 水 定 容 到 100 mL，分 装后高压灭菌。5.17 Tris-HCl，1 mol/L，pH8.0：在 800 mL去离 子水 中 溶解 121.1 g Tris，冷 却至 室 温后 用 浓盐酸调节 溶液 的 pH值 至 8.0，加 水 定 容至 1 L，分 装后高压灭菌。5.18 EDTA，0.5 mol/L，pH8.0：称 取 186.1 g EDTA-Na2 2H2O，加入 700 mL水 中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 10 mol/L氢氧化钠调 pH值 至 8.0，用 水 定 容 到 1 L，分 装后高压灭菌。5.19 CTAB提 取 缓冲液 I：在 800 mL去离 子水 中加入 46.75 g氯化钠，溶解后 加入 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）50 mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 10 mol/L氢氧化钠调节溶液 的 pH值 至 8.0，用 水 定 容至 1 L，分 装后高压灭菌。5.20 CTAB提 取 缓冲液 II：在 800 mL去离 子水 中加入 46.75 g氯化钠，20 g CTAB，完全溶解后 加入 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）50mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL，用 水 定 容至 1 L，分 装后高压灭菌。5.21 Tris饱 和 苯酚 和 三氯甲烷混 合 液，V(Tris饱 和 苯酚)+V(三氯甲烷)=1+1。5.22 三氯甲烷 和 异 戊醇混 合 液，V(三氯甲烷)+V(异 戊醇)=24+1。5.23 TE缓冲液（pH8.0）：在 800 mL水 中，依 次 加入 10 mL的 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）和 2 mL的 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），用 水 定 容 到 1 L，分 装后高压灭菌。6 仪器和设备 DB22/T 2050 2014 3 6.1 实时荧光 PCR仪。6.2 生 物 安 全 柜。6.3 离 心 机：转速 12000 r/min。6.4 核 酸蛋白 分 析 仪或紫 外 分光光 度计。6.5 高压灭菌器。6.6 恒 温 水 浴锅。6.7 移 液器：0.5 L 10 L、10 L 100 L、20 L 200 L、200 L 1 000 L。6.8 pH计。6.9 振荡 器。7 检测步骤 7.1 试样的预处理 50 g固体 样 品 粉碎，颗粒大小 在 0.125 mm以下。7.2 DNA提取和纯化 7.2.1 CTAB法制备非油脂类饲料模板 DNA 称 取 100 mg粉碎 后 的 样 品 于 1.5 mL离 心 管 中，加入 300 L冰上 预 冷的 CTAB提 取 缓冲液 I，加入 500 L于 65 预热 的 CTAB提 取 缓冲液 II，混 匀，65 保温 30 min 90 min，期 间 不 时 轻 缓 颠倒 混 匀；加入 5 L 25 L蛋白 酶 K溶液，上 下 倒转 混 匀，37 水 浴 中 保温 1 h，中 途 每 隔 10 min左右倒转 混 合数 次；待 冷 却至 室 温后 加入 5 L RNase A 溶液（10 mg/mL)，室 温 下 放置 30 min；室 温 12 000r/min 离 心 10 min，取 上 清 液，于 另 一 干 净 的 2 mL离 心 管 中，分 别 用 等 体积 Tris饱 和 苯酚、Tris饱 和 苯酚+三氯甲烷（1+1）和 三氯甲烷+异 戊醇（24+1）抽 提 三 次，12 000r/min 离 心 10 min；将 上 清 液 转移 至干 净 的 2 mL离 心 管 中，加入 等 体积 异 丙醇 及 1/10体积 的 3 mol/L乙酸钠溶液，轻 缓 颠倒 混 匀；12 000r/min 离 心 10 min，弃 上 清液，用 500 L 75%乙醇 洗涤沉淀两次；除 去 残留 的 乙醇，干 燥 后，DNA沉淀 溶解 于 100 L TE缓冲液（预 先 加 热 至 65 有 利 于 溶解 DNA）中，-20 保存 备 用。7.2.2 CTAB法制备油脂类饲料模板 DNA 取 油脂 饲料适量（液 态油 取 30 mL、磷 脂类 和 固态油脂 取 5 g）放 入 250 mL三 角瓶 中，加入 25 mL正己烷，于 磁力搅拌器上 不 断振荡 混 合 2 h后，加入 25 mLCTAB提 取 缓冲液 II，继续 于 磁力搅拌器上 振荡混 合 2 h；将 溶液 转 入 100 mL离 心 管 中，于 8 000 r/min离 心 10 min，使 有 机 相 和 水 相 分 离，取下 层 水 相，加入 与 下 层 水 相 溶液等 体积 的 异 丙醇 及 水 相 溶液 1/10体积 的 3 mol/L乙酸钠溶液，轻 缓 颠倒 混 匀，室 温 放置 10 min；12000 r/min 离 心 10min，弃 上 清 液，待沉淀 干 燥 后 用 200 L TE缓冲液溶解 沉淀，加入 200 L Tris饱 和 苯酚+三氯甲烷（1+1），轻 缓 颠倒 混 匀 溶液；12000 r/min 离 心 10 min，取 上 清 液，加入 与 上 清 液等 体积 三氯甲烷+异 戊醇（24+1），轻 缓 颠倒 混 匀，12000 r/min 离 心 2 min至 分 层；将 上 清 液 转移 至 干 净 的 离 心 管 中，加入 与 溶液等 体积 的 异 丙醇 及 溶液 1/10体积 的 3 mol/L乙酸钠溶液，轻 缓 颠倒 混 匀；室温 放置 10 min后，12000 r/min 离 心 10 min，弃 上 清 液后，依 次 加入 800 L体积 分 数 为 75%的 乙醇 和 100 L体积 分 数 为 75%的 乙醇 洗涤沉淀；12000 r/min 离 心 5 min，除 乙醇溶液；待沉淀 干 燥 后，DNA沉淀 溶解 于 100 L TE缓冲液（预先 加 热 至 65 有 利 于 溶解 DNA）中，-20 保存 备 用。7.2.3 试剂盒法 采 用 商 品 化 的动物源性 基因组 DNA提 取试剂 盒，按照 试剂 盒 使 用 说明 提 取 DNA。DB22/T 2050 2014 4 注：DNA提 取 和 纯 化 过 程 应 用 水 作 为 核 酸 提 取 空 白 对 照。7.3 DNA浓度和纯度的测定 取 10 L DNA溶液 加 蒸馏 水 稀释 至 1 mL，使 用 核 酸蛋白 仪或紫 外 分光光 度计 分 别 检 测 260 nm和 280 nm处 的 吸 光 值。DNA的 浓 度 按照 式（1）计算，当 A260/A280比 值 在 1.5 2.1之间 时，适 宜 于 PCR扩增。扩 增 前将 所有样 品 DNA调至 10 ng/L 50 ng/L。501000ANc=.(1)式 中：c DNA浓 度，单位为 纳克 每 微升（ng/L）；A 260 nm处 的 吸 光 值；N 核 酸 稀释 倍 数。7.4 实时荧光 PCR检验 7.4.1 实时荧光 PCR反应体系 实时荧光 PCR反应 体 系见表 1。每个样 品 设 置 2个 平 行。表 1 实时荧光 PCR反应体系 试 剂 加入量（L）10 PCR 缓冲液 2.5 dNTP溶液(10 mmol/L)1.0 Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.2 上游 引 物(10 mol/L)1.0 下 游 引 物(10 mol/L)1.0 探针（10 mol/L)）1.0 DNA模板（10 ng/L50 ng/L)2.0 补 水 至 25 7.4.2 反应条件 95 预 变 性 2 min，95 变 性 10 s，60 退火延伸 1 min，同 时 收集 FAM荧光，共 进行 40个循环，反应 产物 可 在 4 保存。不 同 仪 器、不 同 Taq DNA聚合酶可 根据 要 求 将 反应 条 件 做 适 当 调 整。检 测过 程 中 设 置 PCR扩增 空 白 对 照、阴 性 对 照和 阳 性 对 照。用 已知 含 有 猪源性成分的 样 品 DNA作阳 性 对 照，用 已知 不 含 有 猪源性成分的 样 品 DNA作 阴 性 对 照，用 等 体积 的 灭菌去离 子水 代替模板 DNA作空 白 对 照。8 结果判断与表述 8.1 质量控制：空 白 对 照：无 扩增曲线，Ct值 40.0；DB22/T 2050 2014 5 阴 性 对 照：无 扩增曲线，Ct值 40.0；阳 性 对 照：出 现典型 的 扩增曲线，Ct值应 35.0；否 则，视 为 无 效。8.2 结果判定和报告：Ct值 40.0，可 判 定 样 品 不 含 有 猪源性成分，可 直接报告未 检出猪源性成分。Ct值 35.0，可 判 定该 样 品 含 有 猪源性成分，报告 检出猪源性成分。35.0 Ct值 40.0，此 时 应 适 当 增 加 DNA模板 量 重做 实时荧光 PCR检 测。重做结果 Ct值 40.0者 为 阴 性，报告未 检出猪源性成分，否 则实时荧光 PCR结果 为 阳 性，报告 检出猪源性成分。9 检测 过程 中 防止交叉污染 的 措 施 按照 GB/T 27403执 行。_