坏死梭杆菌检测 PCR法DB22／T 2015-2014.pdf

ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 2015 2014 坏死梭杆菌检测 PCR法 Determination of Fusobacterium necrophorum Polymerase Chain Reaction 2014-02-28发布 2014-04-30实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2015 2014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009、GB/T 20001.4 2001 给出的规则起草。本标准由吉林省农业委员会提出，吉林省畜牧业管理局归口。本标准起草单位：中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：陈立志、冯二凯、王秀东、刘晓颖、姚志利、王峰、王雷、司方方、范琳琳、徐晶、姜英。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的 责任。DB22/T 2015 2014 1 坏死梭杆菌检测 PCR法 警告使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题，使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合管家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规 定了坏死梭杆菌 的 聚合酶链反应（PCR）检测 方 法。本标准 适用于反刍动物坏死梭杆菌 的 检测和分型。2 规范性引用文件 下列 文件 对于 本文件的 应用是必 不可 少 的。凡是 注 日期 的 引用 文件，仅 注 日期 的 版 本 适用于 本文件。凡是 不注 日期 的 引用 文件，其最新版 本（包括 所 有 的 修改 单）适用于 本文件。GB/T 6682 分析实验室用水 规 格和试验 方 法 WS/T 230 临床诊断 中 聚合酶链式反应（PCR）技术 的 应用 3 术语和定义 下列术语和定义适用于 本文件。3.1 坏死梭杆菌 fusobacterium necrophorum 一种严格厌氧 的 革兰氏阴性多形态 的 条 件 致病杆菌。3.2 PCR 聚合酶链反应 polymerase chain reaction 体外酶促合成 特 异性 DNA片段 的 一种分子生物 学 实验 方 法，主要由 高温变性、低温退火和适温 延伸 三个步骤 反 复 的 热循环 构 成：即模板 DNA先经 高温变性成 单 链，在 DNA聚合酶和适 宜 的 温 度 下，两 条引物分 别 与两 条 模板 DNA链 上 的 一段 互补序 列 发 生退火，接着在 DNA聚合酶 的 催化 下 以四 种 脱 氧 核苷三磷酸（dNTPs）为底 物，使 退火引物 得以延伸。如此 反 复，使 位 于 两 段 已知序 列 之间 的 DNA片段 呈几何倍数扩增。4 缩略语 DNA：脱 氧 核糖核酸（deoxyribonucleosidea acid）。dNTP:脱 氧 核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosbate）。EDTA:乙 二 胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid）。DB22/T 2015 2014 2 5 原理 针 对坏死梭杆菌 白细胞毒素两亚 种 启 动子 的特 异性 区域基因序 列 设计 引物，应用聚合酶链反应（PCR）技术 从 临床 疑似 坏死杆菌病病 料扩增 特 异性 DNA片段，根据 是 否扩增 特 异性片断 及 片断 大小 对坏 死梭杆菌 进行 检测和分型。6 试剂与材料 除非另 有 说明，所 有 的 化 学 试 剂均为 分析 纯。实验用水 规 格应 符 合 GB/T 6682中二 级 水 的规 定 6.1 试剂 6.1.1 引 物 上游 引物：P1:5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3 上游 引物：P2:5-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3 下 游 引物：P3:5-GCACGACAAACCAAATAGC-3 配制 成 10 mol/L，-20保 存。6.1.2 DNA分子 量标准：DL 2000。6.1.3 细 菌 基因组 DNA提 取 试剂盒。6.1.4 dNTP溶液，含 dATP、dTTP、dCTP和 dGTP，各 2.5 mnol/L。6.1.5 DNA聚合酶（5 U/L）。6.1.6 10 PCR buffer（不含氯化镁）（市售）：100 mmol/L KCl,160mmol/L(NH4)2SO4,20 mmol/L MgSO4,200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),1%Triton X-100，1mg/mL BSA。6.1.7 氯化镁（MgCl2）25mmol/L。6.1.8 琼脂糖，电泳级。1%琼脂 糖 凝胶 的 配制：琼脂 糖 1g TAE电泳缓冲液（50倍）2mL 灭 菌 三 蒸 水 98mL 微波炉 中 完全融 化，加溴 化乙 锭（EB）溶液 5 L。6.1.9 TE缓冲液（1）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA。6.1.10 溴化乙锭（10 mg/mL）：称 量 100 mg溴化乙锭溶解于 10 mL水中，然后分装成 1mL/份，4 避光 保 存。6.1.11 50 TAE：称 量 242.0 g Tris溶于 700 mL蒸馏水中，加入 57.1 mL冰乙酸，100 mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）后 定 容至 1000 mL，使用 时 50倍稀释。DB22/T 2015 2014 3 6.1.12 6 Loading Buffer(市售）:含 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青 FF，30%甘油水溶液，4 保 存。6.2 材料 6.2.1 离心 管：1.5 mL。6.2.2 吸头：1000 L。6.2.3 吸头：200 L。6.2.4 吸头：10 L。6.2.5 PCR反应 管。6.2.6 冰盒：12孔 4孔。7 仪器设备 7.1 紫 外分 光光 度计。7.2 PCR仪。7.3 电 子 天平（感量 0.01g）。7.4 紫 外 透射仪或凝胶 成 像系统。7.5 离心 机 12 000 r/min。7.6 核酸 电泳仪。7.7 涡旋振荡器。7.8 微量 可 调移液器：0.2 L 2 L，2 L 20 L，20 L 200 L，100 L 1000 L。7.9 恒 温水 浴锅。7.10 pH计 8 样品 8.1 采 集 用 无 菌 棉拭 子 沾取 疑似 感染 坏死梭杆菌 的 动物病 灶 的 病 健结 合 处 的 组织或脓汁，放入灭 菌 的 冻存 管中，低温 冷藏 保 存（0 4）备 用。8.2 处理 将采回 病 料使 用 200 L TE悬浮，自然沉淀 5 min，2000 r/min离心 3 min，4000 r/min离心 1 min；吸取 上 清至 另 一 灭 菌 EP管，12000 r/min离心 5 min，弃 上 清；加 200 L TE重悬沉淀，12000 r/min离心 5 min，弃 上 清，洗 三 次；沉淀加 200 L TE重悬。8.3 提 取 模版 DNA 按照 细 菌 基因 组 试 剂 盒 说明 书 提 取 坏死梭杆菌 基因 组 DNA。8.4 阳 性 与阴 性 对照 8.4.1 阳 性 对照：坏死梭杆菌 necrophorum亚 种（ATCC 27852）基因 组 DNA；坏死梭杆菌 funduliforme亚 种（ATCC51357）基因 组 DNA；按照 基因 组 试 剂 盒 说明 书 分 别提 取 坏死梭杆菌 necrophorum亚 种（ATCC 27852）和坏死梭杆菌 funduliforme亚 种（ATCC51357）基因 组 DNA。DB22/T 2015 2014 4 8.4.2 隐 性 对照：灭 菌 水 9 检测 9.1 PCR反应 体系 表 1 PCR反应 体系 单位为微升 成分 Component 用 量 dosage dNTP/（2.5 mM each）2.0 10 PCR Buffer/（Mg2阴性）2.5 引物 L7/(10 mM)1.0 引物 L8/(10 mM)1.0 引物 L9/(10 mM)1.0 Mg2/（25 mM）3.5 DNA模 版 2.0 Taq酶/（5 U/L）0.2 灭 菌 双蒸 水 定 容 至 25.0 注：按照 上 述 试 剂 顺 序 逐项加 样 至 已 编好号 的 0.2mL的 PCR反应 管中 比，混匀后瞬 离 9.2 PCR反应 程序 9.2.1 预变 性 95，10 min；9.2.2 循环扩增 94 1 min，56 50 s，72 1 min，30个循环；9.2.3 延伸 72，10 min。4保 存。9.3 扩增产 物电泳 用 TAE电泳缓冲液 配制 成 1%琼脂 糖 平 板（溴 化乙 锭 终浓 度 0.5 g/mL）。将平 板 放入 水 平电泳 槽 中，加入 1 TAE电泳缓冲液 刚刚 高 出 凝胶 表面，将 PCR扩增 产 物 6 L与 6 L上 样 缓冲液 混 合，分 别 加入 样品 孔中，取 5 L DNA Marker DL2000加入 到 标准 分子 量 对 照 孔 内。5V/cm恒 压 电泳 30-45min。10 结果判 定 DB22/T 2015 2014 5 用 凝胶 成 像系统 进行 分析。在 阴性和 阳 性对 照 成 立 情况 下，若待 检 样品 出 现 1 076 bp特 异性片段，即 判 定 为 Fnn亚 型；出 现 809 bp特 异性片段，即为 Fnf亚 型。必 要 时 取 PCR扩增 产 物 进行 测 序，如 果 结 果 与 附录 A参考 序 列 比较，序 列 相 似 性 在 95%以上，可 进 一 步 确认待 测 样品 结 果 为 阳 性（标准 序 列 见附录 A1、A2）。11 废弃 物处理 和 防止污染 的措施。11.1 检测 过程 中的 废 弃 物 进行 无 害 化 处 理。11.2 检测 过程 中 防止交叉污 染 的 措施 按照 WS/T 230中 污 染 的 预防 和 控 制 规 定 执 行。DB22/T 2015 2014 6 附 录 A（资 料 性 附录）坏死梭杆菌 亚型判 定的 特征 性 序列 A1.坏死梭杆菌 Fnn型白 细 胞毒素启动 子 区扩增片段序列：GCTTTCCTGCTTGTTTATTTCTCATGATCTTTTTGTTGTTCGAAATATTTGCGATAGAGTTTTGATTATGAAAGAAGGGAAAATCATAGAAGAAGGAAAGAAAGAGGAAATCTTTAAAGCACCGAAAAAAGAGTATACTCAATTTTTGCTGGAAGTGAGTATGAGTTTTATATTTTGATATAAAATCGAATAAAAAGGTATTTTTTTGAAGAAAGGAAGCTTATCTTAACATAGATTTAACATTTGATGTGATAGCATGAATTTAATATAAAATGCTGAAAATGTATCTAAAAATAATATAAAAAGAACATTGTATTTCCATAAAAAAATATTTTTTTAAATAAATATTTTATATAAAAAAATAATTAAATTTAAACTAGACATACAATAAGAAATATGCTAATCTAATAACGCTTGATATTTTAAAAAAATTAAAAATCATGAATACAATAGATGTTTATATCATTTGAGCTTCTTTTTTGAAAAACAGGAATTGTATTTTAATATAAAAAAATACTTCTTAAGATGAATATTTTATATAAAAAAATAATTAAATTCGAACTAGACATATGATAAGAAATATGCTAGTCTAATAACAGTTGATATTTTAAAAAAATTAAAAATTCATAAAAAATAAAATTGGGAGAAATTATGTTTCATTTAAAAAAAGAATTAAAAACATTTGTTTTTTTTATGTTGATTTTAAGTTGCCCAAATATATTGGCAGAAGGAATTCAAACATCCTCTACAGAATCGGATGCTGGAATGCTACTTGATAGAAACAACAGGATATTTCAACAAGGAAAATTACAGAAGATTTTGCATTCTGAGAAAGAAAAACGAAAACAAGGAATTGAAAATTTGGAGAAGAAAAAGGAAGAAGATATCAAAGTATCAGATGTTTCTTTTTTATTAAAAAAATTGGAGATTCCAAAGTCTGATATTTTAACAGAAGAAGAAATCGTAAGGATTTGGGAGCCCTATATAGAAAAAGAAGTTACCGTTGCAGATCTTTATACTATAGTTCAAAAAATCAATGAATTATATCAGGAAAAAGGCTATTTGGTTTGTCGTGC A A2.坏死梭杆菌 Fnf亚型白 细 胞毒素启动 子 区扩增目 标 序列 CAATTTTTGTTGGAAGCGAGTATACAATTTTTGTATGAAAAAGATAAAAAGAGAATATAAATTTTGGCTGTTTAAATTTTTTAAACAGCTTTTTTATTTTTGGAATAAAAAAATTAGGAAAGTATATCAAAAAATGAAAAAGAAACCATAAAAATAAAAAAACAAAAAATAATTGTTTTATTTTCGATAAATAAGAAAAAATAGGTATTTTATAATTTTTAAAAAATTAAAATGTTCTGAAATTATAAAAATATTTCTTAAAACGAATATTTTATATAGAAATACGTTCAAATTCAAGCTAGACATATTGTGAGAAATATGTTATTTTGATAATGGCTGTTATTTAATAAAAATTAAAAATTCATGAAAAATAAAATTAGGAGAAATTATGTTTCAGTTAAAGAAAGCTTTGAAAATACTTCTTTTTTTATCGATATTCAATAGCTCAAGTGTTTTTGCAGAAGAAGTCGGAATATTATCTACAGAATTGGATTCCGGAATATTAACAGATAGAAATAATAAAATATTCCAACAAGAAAAATTACAAAGAACATTGAAGTACGAAAAAGAGAAACGAAAGCAGGGAATTGAAAATTTAGAGGAGAGAAAGGAAGAAGATATCAAAGTATCGGATGTTTCTTTTTTATTAAAAAAAATGGAGATTCCAAAGTCTGATATTTTAACAGAACAAGAAATGGAAAGGATTTGGGAATCCTATATAGAAAAAGAGATTACTATTACAGAGCTTTATACCATAGTTCAAAAAATCAATGAATTATATCAGGAAAAAGGCTATTTGGTTTGTCGTGC _