猴头菇菌种制作技术规程DB15／T 1132-2017.pdf

ICS 65.020.20 B 05 备案号：52672-2017 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1132 2017 猴头菇菌 种制作技 术规程 Regulation of Strain Manufacture for Hericium erinaceus 2017-01-15 发布 2017-04-15 实施 内 蒙 古 自 治 区 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB15/T 1132 2017 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 菌 种生 产要 求.2 5 母 种生 产.2 6 原 种、栽培 种生 产.3 附 录A（资 料性 附录）母种常 用培 养基 配方.7 附 录B（资 料性 附录）原种、栽培 种常 用培 养基 配方.8 DB15/T 1132 2017 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 编写。本标准 由内 蒙古 自治 区农 牧业科 学院 提出。本标准 由内 蒙古 自治 区农 牧业厅 归口。本标准 起草 单位：内 蒙古 自治区 农牧 业科 学院。本标准 主要 起草 人：王海 燕、孙 国琴、庞 杰、刘承 普 康 立茹、解 亚杰、于 静、李亚 娇。DB15/T 1132 2017 1 猴 头菇菌 种制作技 术规程 1 范围 本标准 规定 了制 作猴 头菇（Hericium erinaceus）母 种、原 种和 栽培 种制 作技 术流程 要点 等。本标准 适用 于 猴 头菇 母种、原种 和栽 培种 菌种 制作 要求。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅 注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。NY/T 1731 食 用菌 菌种 良 好作业 规范 NY/T 1742 食 用菌 菌种 通 用技术 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 菌种 spawn 通过生 产试 验验 证具 有特 异性、均一 性和 稳定 性，丰产性 好、抗性 强的 猴头 菇 菌株 或品 种，培养 生长在适 宜基 质上 具结 实性 的菌丝 培养 物，包括 母种、原种 和栽 培种。3.2 母种 stock culture 经各种 方法 选育 得到 的具 有结实 性的 菌丝 体纯 培养 物及其 继代 培养 物，以玻 璃 试管或 培养 皿为 培养容器和 使用 单位，也 称为 一级种、试 管种。3.3 原种 pre-culture spawn 由母种 移植、扩 大培 养而 成的菌 丝体 纯培 养物。常 以菌种 瓶（玻璃 菌种 瓶或 塑料菌 种瓶）或 聚丙 烯塑料袋 为容 器。也称 为二 级种。3.4 栽培 种spawn 由原种 移植、扩 大培 养而 成的菌 丝体 纯培 养物。常 以菌种 瓶（玻璃 瓶或 塑料 瓶）或 聚丙 烯塑 料袋 为容器。栽培 种只 能用 于扩 大到栽 培出菇 袋 或直 接出 菇，不 可以 再次 扩大 繁殖 菌种。也称 为三 级种。DB15/T 1132 2017 2 3.5 固体菌 种solid spawn 以富含 木质 素、纤维 素 和 半纤维 素或 淀粉 含量 高的 谷物粒 等天 然物 为主 要原 料，添 加适 量的 有机 氮源和无 机盐 类，具一 定水 分含量 的培 养基 培养 的纯 菌丝体。3.6 液体菌 种liquid spawn 指采用 与母 种营 养成 份相 同不加 琼脂 的液 体培 养基 培养而 得到 的菌 丝体，菌 丝 体在培 养基 中呈 絮状或球状，液 体菌 种可 以作 为原种 或栽 培种 直接 接种 在培养 袋中。4 菌种生 产要 求 4.1 人员 从事菌 种生 产 的 技术 人员 和检验 人员 应经 过专 业培 训、掌 握 猴 头菇 基础 知识 及 猴头菇 菌种 生产 技术规程要 求的 相应 专业 技术 人员。4.2 场地、厂房 要求 菌种生 产 应 选择 地势 高，通风良 好，空 气清 新，水 源近，排 水通 畅，交 通便 利 的场 所。1000m 之内无酿造 厂、集贸 市场、规 模养殖 的畜 禽舍、垃 圾和 粪便堆 积场，无 污水、废 气、废 渣、烟 尘和 粉尘 等 污染源。菌种生 产厂 房 应 有隔 离的 摊晒场、原材 料库、配 料分 装库。配 套有 配料 室、搅拌 室、装袋（瓶）室、灭菌室、冷 却室、接 种室、培养 室（通风 好，有纱 窗）、菌种 检测 室及 菌种 冷 藏库等 各环 节的 设施。冷却室、接种 室、培养 室 应 有离子 净化 设施。4.3 生产设 备 菌种生 产 应 有粉 碎机、电 子秤、拌料 机、装袋（瓶）机、高压 灭菌 锅或 常压 灭菌锅、离 子净 化 器、超净工 作台 或接 种箱、恒 温培养 箱、培养 架、摇床、生物 显微 镜等 设备，生 产液体 菌种 还 应 有液体菌种罐。5 母种生 产 5.1 培养基 参见附 录A。5.2 容器 试管规格为 18mm 180mm 或者 20mm 200mm；培养 皿 选用 直径 7cm 9cm 玻璃培养 皿或 一次 性塑料培养 皿。5.3 培养基 分装 和灭 菌 DB15/T 1132 2017 3 5.3.1 斜面培 养基 分装 和灭 菌 分装培 养基 至试 管1/4 处，用棉塞（应 采用 梳棉，不 能使用 脱脂 棉）或硅 胶塞 封闭试 管口，每5支试管为1 把，牛 皮纸 包棉 塞，橡皮筋 扎紧，棉塞 向上 置 于灭菌 锅中。在121124（0.11MPa 0.12MPa）下灭菌25min。灭菌后 温度降到（65 5）时，在空气清洁的室内摆斜面，要求 斜面长度不超过试管长度的2/3，冷却凝 固后 备用。从 摆好 的试管 中抽 取3%5%的试 管，在28 下培 养48h，无 微生物 长出 为灭 菌合 格。5.3.2 平板培 养基 分装 和灭 菌 培养基 装入300ml 500ml 三角瓶至 刻度的2/3 处，用 带滤膜的封口膜封口 后放 入灭菌锅。玻璃培 养皿用报 纸包 好，同时 放入 灭菌锅 灭菌。在121 124（0.11MPa 0.12MPa）下灭 菌25min。灭菌后 温度 降到（65 5）时，在超 净工 作台 上将 三角瓶 中的 培养 基分 装至 培养皿 中，培养 基占培养皿 高度 的 1/3 1/2，冷却凝 固后 备用。5.4 接种 在超净 工作 台或 接种 箱内 接种。接种 前用 紫外 灭菌 灯照射30min 后再用75%酒 精进行 表面 消毒。接菌过 程 严 格执 行无 菌操 作，接 种后 及时 贴好 标签 并做好 记录。将3mm 5mm 的菌种块 接 种在培 养皿 或试 管的 中部。培养 皿用 石腊 封口 膜密 封。5.5 培养 在18 26，空气 湿度 在75%以下，通 风 避 光培 养。接种后 第3 天、第5天 和 长 满培养 基后 分别 进行 逐个 检验，保留 菌丝 体生 长健 壮、洁 白、浓密，菌 落边缘整 齐，无分 泌物 的母 种，其 余淘 汰。菌丝长 满试 管斜 面或 培养 皿表面 即可 使用。6 原种、栽培 种生 产 6.1 固体菌 种 6.1.1 培养基 参见附 录B。6.1.2 容器 原种采用850ml 以下、瓶 口 直径 4cm、耐126 高温的 菌种 瓶，或选 用（1217）cm（22 28）cm（0.04 0.05）mm 的 聚丙烯 塑料 袋。栽 培种 采用 和 原 种相 同的 菌 种瓶，或 选用（15 17）cm（33 35）cm（0.04 0.05）mm的 聚丙烯塑料 袋。6.1.3 装袋（瓶）采用装 袋（瓶）机 或人 工 进行装 袋（瓶），人 工装 袋（瓶）用 锥形 木棍 在袋 口 处打孔，孔 直径 1cm 1.5cm 深度为 8cm 12cm，每袋（瓶）装 干培 养 基 500g 600g。DB15/T 1132 2017 4 6.1.4 灭菌 培养基 装袋（瓶）后4h内 进行灭 菌，灭菌 可分 为高 压灭菌 和常 压灭 菌。高压灭 菌：组 合培 养料 在121 124（0.11MPa 0.14 Mpa）下 灭菌2h；粮 食培 养 基在121124（0.11Mpa 0.14 Mpa）下 灭菌2.5h。常压灭 菌：在3h 之内 使灭 菌温度 达到100，保持100 10h 12h。6.1.5 接种 原种、栽培种在超净工作 台或接种箱内 接种，接 种 前 打开紫外灯照射30min，接种时用75%酒精 对超净工 作台 或接 种箱 进行 表面擦 拭消 毒。每瓶（袋）原种接 入2cm 3cm 大小 母 种1块2块；每 瓶（袋）栽培种 接入 原种 量不 得少 于15g。要严格 按无 菌操 作接 种，每批接 种应 为单 一品 种，如中途 换品 种时 采 用 75%酒精对 超净 工作 台或接种箱 进行 表面 擦拭 消毒。6.1.6 培养 在21 26，空气 湿度 在75%以下，通 风 避 光培 养。6.1.7 贮存 原种和 栽 培 种在0 4 下贮存，贮 存期 不超 过50d。6.2 液体菌 种生 产 6.2.1 培养基 按附录 A 中 规定。灭菌 同 5.3.2。6.2.2 三角瓶 液体 菌种 生产 采用150ml 500ml 三角瓶，培养 基添 加至 刻度 的2/3 处，用 带滤 膜的 封口 膜封 口后灭 菌。灭菌 条件同5.3.2。取 3mm 5mm 大小母 种 10 块12 块 放进 液体 培养 基 中，培养 温度 16 26，振 荡频 率（搅拌速度）140 r/min 160 r/min 下振 荡培 养 8d 10d。6.2.3 菌种 罐 液体 菌种 生产 条件 6.2.3.1 装罐和 灭菌 填装培养基至 液体菌种罐2/3 处，按照液体菌种罐说明书要求，对 液体菌种罐和液 体培养基 灭菌，待液体 培养 基冷 却至30 以下时 进行 接种。6.2.3.2 接种与 培养 将培养 好的 三角 瓶液 体菌 种接入 到液 体菌 种罐 中，接种量 为培 养基 总体 积 的 8%10%，培 养温 度（23 2），搅 拌转 速 150 r/min 160r/min，灌压 0.04Mpa，通 风量 0.7N m3/h。培养 时 间 3d 5d。7 检验、入库 及留 样 DB15/T 1132 2017 5 7.1 检验 7.1.1 母种感 官要 求见表 1.表1 猴头菇 母种 感官 要求 项目 要求 容器 完整、无损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和过滤要求 培养基灌入量 为试管总容积的1/4，培养皿高 的的1/3 1/2 菌丝生长量 长满斜面或平板 菌丝体特征 菌丝体色泽 洁白、平整、点片状或星芒状 菌丝体表面 均匀、舒展、平整 菌丝体分泌物 无 菌落边缘 整齐 杂菌菌落 无 斜面背面外观 培养基不干缩，颜色均匀，无暗斑、无色素 7.1.2 原种感 官要 求见 表 2。表2 猴头菇 原种 感官 要求 项目 要求 容器 完整、无破损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口的距离（50 5）mm 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 菌丝体 白、生长旺健、整齐 培养物表面菌丝体 生长均匀、无高温抑制线 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 菌丝分泌物 无、允许少量无色至棕黄色水珠 杂菌菌落 无 子实体原基 无 7.1.3 栽培种 感官 要求 见 表 3。表3 猴头菇 栽培 种感 官要 求 项目 要求 容器 完整、无破损 棉塞或 无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口的距离（50 5）mm 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 生长均匀、色泽一致、无角变、无高温抑制线 DB15/T 1132 2017 6 表 3（续）项目 要求 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 菌丝分泌物 无 杂菌菌落 无 子实体原基 允许少量、出现原基种类5%7.1.4 液体菌 种感 官要 求见 表 4。表4 猴头菇 液体 菌种 感官 要求 项目 要求 容器 完整、无破损、无裂纹 菌丝生长量 培养基 1/2 1/3 菌丝体特征 白色至透明块状、生长旺健 培养基 清澈、无杂色 杂菌 无杂菌 7.2 入库 检验参 照NY/T 1742 和NY/T 1731 要求 中关 于 猴 头菇 的论述 要求。菌种 检验 完 成后应 及时 入菌 种库，详细记 录各 生产 环节，菌 种库温 度 保 持在0 4，避光，适 当通 风但 应该 对空气 进行 消毒。菌种 在 库中 贮 存 时间 不应 长于50d，贮存 时间 超出50d 的母 种应 进行 出菇 检验 后 再进行 后续 生产。7.3 留样 菌种 应 留样，每 批次 留 样 3 支试 管，贮存 在 0 4，贮 存至 正常 生产 条件 下出第 一潮 菇。DB15/T 1132 2017 7 A A 附 录 A（资料 性附 录）母种常 用培 养基 配方 A.1 PDA 改 良培 养基 A.1.1 麦麸100g 加 水600ml 煮沸20min，取滤 液500ml；新鲜 无病去 皮马 铃薯200g 加水600ml煮沸15min，取滤液500ml，二 者混 合 定 容至1000ml，加 入硫 酸镁（MgSO4）0.5g、磷酸 二氢 钾（KH2PO4）1g、葡萄 糖10g、蔗糖10g、琼脂 粉10g 15g（用 少量 凉水 调成 糊 状），pH 自然。A.1.2 新鲜无 病去 皮马 铃薯200g 加水1200ml 煮沸15min，取 滤液再 加入 蛋白 胨1g、酵 母粉1g、硫 酸镁（MgSO4）0.5g、磷 酸二 氢钾（KH2PO4）1g、葡 萄糖10g、蔗糖10g、琼脂 粉10g 15g（用少 量凉 水调 成糊 状）定容至1000ml，pH自然。A.1.3 麦粒100g加水1200ml 煮沸15min，取滤 液再 加入 硫酸 镁（MgSO4）0.5g、磷酸 二 氢钾（KH2PO4）1g、葡萄糖10g、蔗糖10g、蛋 白胨5g、琼脂 粉10g 15g（用少 量凉 水调 成糊 状）定容至1000ml，pH自然。A.1.4 新鲜无 病去 皮马铃 薯200g 加水600ml煮沸20min，取 滤液500ml；100g小 麦粒加水600ml 煮沸15min，取滤液500ml，二者混合 定容至1000ml，加入硫酸镁（MgSO4）0.5g、磷 酸二氢钾（KH2PO4）1g、蔗糖10g、琼脂 粉10g 15g（用少量 凉水 调成 糊状），pH 自然。A.2 PDA 培 养基 新 鲜无 病去皮 马铃 薯200g加水1200ml 煮沸20min，取滤 液再 加入硫 酸镁（MgSO4）0.5g、磷 酸二氢钾（KH2PO4）1g、葡萄 糖10g、蔗糖20g、琼脂 粉10g 15g（用少 量凉 水调 成 糊 状），定容 至1000ml，pH 自然。A.3 制作液 体菌 种培 养基 不加 琼脂粉。DB15/T 1132 2017 8 B B 附 录 B（资料 性附 录）原种、栽培 种常 用培 养基 配方 B.1 粮食培 养基 谷粒、麦粒或玉米粒90%，柠条粉、棉籽壳、木屑、玉米芯粉或豆秸粉9%，石膏1%，水分含量（502）%，石 灰水 调节pH至6 7。B.2 组合培 养基 B.2.1 阔叶木 屑58%、玉米 芯21%、麸皮20%、石 膏1%、水 分 含量（602）%、石 灰水 调节pH 至6 7。B.2.2 柠条粉60%、玉 米芯21%、麸皮18%、石膏1%、水分 含 量（60 2）%、石灰 水调 节pH 至6 7。B.2.3 豆秸粉60%、玉 米芯21%、麸皮18%、石膏1%、水分 含 量（60 2）%、石灰 水调 节pH 至6 7。B.2.4 棉籽壳80%、麸 皮19%、石 膏1%、水分 含量（60 2）%、石 灰水 调节pH 至6 7。B.2.5 柠条粉80%、麸 皮19%、石 膏1%、水分 含量（60 2）%、石 灰水 调节pH 至6 7。_