饲料中构巢曲霉测定 实时荧光PCR方法DB22／T 2053-2014.pdf

ICS 07.100.30 B 20 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 2053 2014 饲料中构巢曲霉测定 实时荧光 PCR方法 Determination of Aspergillus nidulans in feedstuffs Real-time PCR method 2014-02-28发布 2014-04-30实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2053 2014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、王莹、郎乐、张庆波、韩冰雪、李媛媛、王庆峰。DB22/T 2053 2014 1 饲料中构巢曲霉测定 实时荧光 PCR方法 1 范围 本标准规定了饲料中构巢曲霉的实时荧光 PCR检验方法。本标准适用于饲料中构巢曲霉的快速筛选检测。2 规范性引用文件 下列文件对 于本 文件 的 应 用 是必不可少 的。凡是注日期 的 引 用 文件，仅所注日期 的 版 本适用于本 文 件。凡是不注日期 的 引 用 文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本 文件。GB/T 6682 分析 实验 室 用 水 规 格 和 试 验方法 GB/T 13092 饲料中霉 菌总数 的测定 GB/T 27403 实验 室 质量 控制 规 范 食 品 分子生物学 检测 3 术语和定义 下列 术 语 和定 义 适用于本 文件。3.1 实时荧光 PCR real-time fluorescent PCR 实时荧光 聚合酶链式反应。3.2 Ct值 cycle threshold value 每个反应管内 的荧光 信号达到设 定的 阈值 时 所经历 的 循环数。4 原理 对样 品的 培养物进行 DNA提 取，通过 实时荧光 PCR扩增，观察 实时荧光 PCR的 增幅 曲 线，从而对 饲 料中的构巢曲霉 进行 快速检测。5 试剂 除特别说明以外，所有试剂均为分析 纯，水为 按照 GB/T 6682规定的 一级 水。所有试剂均 用 无 DNA酶 污染 的 容器 分 装。5.1 引物 及探针：a)上游 引物：5-GGCTACACCGAGGACGACAT-3 b)下 游 引物：5-CCCGCCTTAGCATCGAAGA-3 DB22/T 2053 2014 2 c)探针：5-FAM-TCAACGGTGACACCCGCTCTT-TAMRA-3 5.2 Taq DNA聚合酶。5.3 dNTP：dATP（deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosina triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。5.4 真 菌 基因组 DNA提 取 纯化 试剂 盒。5.5 10 PCR缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L氯化钾（KCl），15 mmol/L氯化镁（MgCl2）。5.6 高盐 察 氏 培养 基：按 GB/T 13092规定。5.7 构巢曲霉质 控菌 株：来源 于 正 规 菌 种保藏机 构的标准 菌 株。6 仪器和设备 6.1 实时荧光 PCR仪。6.2 生物 安全柜：AII型。6.3 霉 菌培养 箱。6.4 离 心 机：转 速 12 000 r/min。6.5 核酸蛋白 分析 仪或紫 外分 光光 度计。6.6 高压灭 菌 器。6.7 恒温 水 浴锅。6.8 天平：感 量 0.1g。6.9 移液器：0.2 L 2 L、2 L 10 L、20 L 200 L、100 L 1 000 L。6.10 均 质 器或乳钵。6.11 涡旋混 合 器 6.12 实时荧光 PCR反应管。6.13 离 心 管：1.5 mL。7 检测步骤 7.1 样品制备与培养 参 照 GB/T 13092对样 品 进行制 备与 培养。7.2 DNA提取 7.2.1 DNA模板制备 从培养 平皿上刮 取菌 丝 0.2 g 0.5 g于 1.5 mL离 心 管，使 用 真 菌 基因组 DNA提 取试剂 盒 并按 其说明提 取制 备模板 DNA。提 取 的 DNA溶液 可 于-20 保存。7.2.2 DNA浓度测定 取 10 L DNA溶液 加 蒸馏 水 稀释 至 1 mL，使 用 核酸蛋白仪或紫 外分 光光 度计 分别 检测 260 nm和 280 nm处 的 吸 光 值。DNA的 浓 度 按照 式（1）计 算，当 A260/A280比 值 在 1.5 2.1之间 时，适 宜 于 PCR扩增。扩 增 前将 所有样 品 DNA调至 10 ng/L 50 ng/L。DB22/T 2053 2014 3 501000ANc=.(1)式 中：c DNA浓 度，单位 为 纳克 每 微升（ng/L）；A 260 nm处 的 吸 光 值；N 核酸稀释 倍 数。7.3 实时荧光 PCR检验 7.3.1 实时荧光 PCR反应体系 10 PCR缓冲液 2.5 L、引物对（10 mol/L）各 1 L、探针（10 mol/L）1 L、dNTP（10 mmol/L）1 L、Taq DNA聚合酶（5 U/L）0.5 L、模板 DNA 2 L、用 灭 菌 去 离 子水 补足体积至 25 L。7.3.2 实时荧光 PCR反应条件 95 预变性 2 min，95 变性 10 s，60 退火延伸 1 min，同 时 收集 FAM荧光，共 进行 40个循环，反应 产 物可 在 4 保存。不 同 仪器、不 同 Taq DNA聚合酶可 根据 要 求将 反应 条 件 做 适 当调整。检验 过 程 中 分别设 置空 白 对 照、阴性 对 照、阳性 对 照。空 白 对 照 设为以 无 菌水 代替 DNA模板；阴性 对 照 采 用 非 构巢曲霉 DNA作 为 实时荧光 PCR反应 的 模板；阳性 对 照 采 用构巢曲霉 DNA作 为 实时荧光PCR反应 的 模板。8 结果判定与报告 8.1 质量控制 空 白 对 照：无 扩增 曲 线，Ct值 40.0；阴性 对 照：无 扩增 曲 线，Ct值 40.0；阳性 对 照：出 现典 型 的 扩增 曲 线，Ct值应 35.0；否 则，视 为 无 效。8.2 结果判定和报告 Ct值 40.0，可 判 定 样 品实时荧光 PCR结果 为 阴性，可 直接报告未 检出构巢曲霉；Ct值 35.0，可 判 定 样 品实时荧光 PCR结果 为 阳性，按 附录 A进行 确证。确证 试 验 结果 为 构 巢曲霉，则 报告 检出构巢曲霉；35.0 Ct值 40.0，此 时 应 适 当 增 加 DNA模板 量 重做 实时荧光 PCR检测。重做结果 Ct值 40.0者 为 阴性，报告未 检出构巢曲霉。否 则实时荧光 PCR结果 为 阳性，按 附录 A进行 确证。确证试 验 结果 为 构巢曲霉，则 报告 检出构巢曲霉。9 生物安全措施 为 了 保 护 实验 室 人 员 的 安全，应 由 具 备 资 格 的工 作 人 员 进行 检测，所有培养物 和 废弃 物应 小 心 处置，并按 GB/T 27403中的 有 关 规定 执 行。10 废弃物处理和防止污染的措施 DB22/T 2053 2014 4 10.1 检验 过 程 中的 废弃 物 需 经 121 高压灭 菌 处理至 少 30 min后再弃置。10.2 检验 过 程 中 防止交叉 污染 的 措施 按照 GB/T 27403执 行。DB22/T 2053 2014 5 A A 附 录 A（规范性附录）构巢曲霉 确证 方法 A.1 设备 A.1.1 显微镜：10 100。A.1.2 目 镜 测 微 计。A.1.3 物 镜 测 微 计。A.1.4 无 菌 接 种 罩。A.1.5 放大 镜。A.1.6 滴瓶。A.1.7 接 种 钩 针。A.1.8 分 离针。A.1.9 载玻片。A.1.10 盖玻片：18 mm 18 mm。A.1.11 灭 菌 刀 子。A.2 试剂 A.2.1 乳酸-苯酚 液 苯酚 10 g，乳酸（密 度 1.21 kg/m3）10 g，甘油 20 g，蒸馏 水 10 mL。将 苯酚 在 水 中加 热 溶 解，然 后 加入 乳酸及 甘油。A.3 操作 步骤 A.3.1 制 片 取 载玻片 加 乳酸-苯酚 液一 滴，用 接 种针 取 一 小 块 霉 菌培养物（尽 量 是 纯 培养物），置 乳酸-苯酚 液中，用 两支 分 离针 将 培养物 撕开成 小 块，切忌涂抹，以 免破坏 霉 菌 结 构；然 后 加 盖玻片，如 有 气泡，可在 酒精灯 上 加 热排 除。制 片 时 最 好 是 在接 种 罩 内 操 作，以 防 孢 子 飞扬。A.3.2 镜 检 观察 霉 菌 的 菌 丝 和 孢 子 的 形态 和 特 征、孢 子 的 排 列 等，并 做 详细记 录。A.3.3 构巢曲霉 形态 特 征 构巢曲霉 菌 落 生 长较 快，14 d直 径 5 cm 6 cm，绒状，绿色，有 的 菌 系 由于产 生 较多 的 闭囊壳 而 显现 黄色，反 面 紫 红色。分生 孢 子 头短柱形，(40 m 80 m)(25 m 40 m)。分生 孢 子 梗极短，常弯 曲，一 般 75 m 100 m，近顶囊 处直 径 3.5 m 5 m，褐色，壁 光 滑。顶囊半球形，直 径 8 m 10 m。小 梗双层，梗 基(5 m 6 m)(2 m 3 m)，小 梗（5 m 6 m）(2 m 2.5 m)。分生 孢 子 球形，DB22/T 2053 2014 6 粗糙，直 径 3 m 3.5 m。闭囊壳球形，暗 紫 红色，直 径 135 m 150 m。子 囊孢 子 双凸 镜 形，紫 红色，约 5 m 4 m，有 两 个 鸡冠状突 起。闭囊壳 外 面 包 围着 一 层壳细 胞，淡 黄色，球形，壁 厚，直 径约 25 m（见图 1）。A.4 报告 根据 菌 落形态 及 镜 检 结果，参 照构巢曲霉的 形态 描述，确 定 是 否 为 构巢曲霉。图 1 构巢曲霉 _