水产苗种中硝基呋喃类原药残留量的测定 液相色谱-串联质谱法DB37／T 1779-2011.pdf

ICS 65.150 B 50 DB37 山东省地方标准 DB37/T 17792011 水产苗种中硝基呋喃类原药残留量的测定液相色谱-串联质谱法 2011-01-06 发布 2011-03-01 实施山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 17792011 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。本标准由山东省海洋渔业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省海洋水产研究所、山东省水产品质量检验中心。本标准主要起草人：孙玉增、徐英江、田秀慧、张世娟、李佳蔚、于召强。DB37/T 17792011 1 水产苗种中硝基呋喃类原药残留量的测定液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了水产苗种中硝基呋喃类原药残留量测定的液相色谱-串联质谱法。本标准适用于水产苗种中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮残留量的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 水产苗种违禁药物抽检技术规范农业部1192号公告-1-2009 3 原理 样品中硝基呋喃类原药残留用甲醇偏磷酸溶液提取，经固相萃取柱净化后，用液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。4 试剂和材料 4.1 试验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。所用试剂除另有指定外，均为分析纯。4.2 甲醇：色谱纯。4.3 偏磷酸。4.4 乙酸铵。4.5 0.2%偏磷酸溶液：0.2 g偏磷酸加 100 mL 水溶解，混匀。4.6 甲醇-偏磷酸溶液（4060）：甲醇（4.1）40 mL加 0.2%偏磷酸溶液（4.4）60 mL，混匀。4.7 5.0 mmol/L乙酸铵溶液：称取乙酸铵（4.3）0.19 g 用水溶解并定容至 500 mL。4.8 标准品：呋喃唑酮和呋喃西林纯度均为 99.0%，呋喃妥因纯度为 98.5%，呋喃它酮纯度为 94.0%。4.9 标准储备液（100 g/mL）:准确称取呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮各适量，用甲醇溶解并定容至 100 mL棕色容量瓶中，配成浓度为 100 g/mL 的标准储备液，18 冰箱中保存，保存期 6 个月。4.10 混合标准工作溶液：使用前取标准储备液（4.8），用甲醇稀释成所需浓度。5 仪器和设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪，配电喷雾（ESI）离子源。5.2 涡旋混合器。5.3 离心机：7000 r/min。DB37/T 17792011 2 5.4 天平（感量 0.001 g）。5.5 分析天平（感量 0.00001 g）。5.6 HLB 固相萃取柱（60 mg，3 mL）。5.7 均质机。5.8 超声波清洗仪。5.9 氮吹仪。6 试样的测定 6.1 样品的制备 按照水产苗种违禁药物抽检技术规范执行。6.2 样品的提取 称取匀浆后样品10.0 g 于50 mL 离心管中，加入15 mL 甲醇偏磷酸溶液（4.5），涡旋混合30 s，超声提取 10 min，7 000 r/min 离心10 min，取上清液于至另一离心管中，再用15 mL 甲醇-偏磷酸溶液提取一次，合并上清液，备用。6.3 样品的净化 HLB固相萃取小柱依次用5 mL水和5 mL甲醇活化，取备用液全部过柱（流速不超过1 mL/min），用5 mL 10%甲醇淋洗，用5 mL 甲醇洗脱，35 水浴氮气吹近干。残渣用流动相溶解，定容至1 mL，过0.22 m滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。6.4 测定 6.4.1 色谱条件 6.4.1.1 色谱柱：BEH C18，2.1100 mm，1.7 m；或相当者。6.4.1.2 流动相：A 相：5.0 mmol/L 乙酸铵溶液；B 相：甲醇。6.4.1.3 流速：0.25 mL/min。6.4.1.4 进样量：10 L。6.4.1.5 柱温：35。6.4.1.6 流动相梯度洗脱程序见表 1。表1 流动相梯度洗脱程序 时间，min A相，%B相，%0 95 5 1.0 95 5 3.0 5 95 4.0 5 95 5.0 95 5 6.4.2 质谱条件 条件包括：DB37/T 17792011 3 a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描（ESI+）和负离子扫描(ESI-)分段扫描；c)检测方式：多反应监测（MRM）；d)电离电压：2.5 kV；e)离子源温度：110；f)雾化温度：350；g)雾化气流速：700 L/h；h)各药物母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量和离子化方式见表 2。表2 硝基呋喃类药物的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量和离子化方式 目标化合物 母离子 m/z 子离子 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 离子化方式 225.8 121.6*28 20 呋喃唑酮 225.8 138.7 28 15 ESI+197.0 80.0 15 10 呋喃西林 197.0 124.0*15 10 ESI-236.8 123.0 28 12 呋喃妥因 236.8 151.0*28 15 ESI-325.0 251.9 28 15 呋喃它酮 325.0 281.0*28 12 ESI+注：*为定量碎片离子 6.4.3 液相色谱-串联质谱分析 6.4.3.1 定性方法 在同样测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间相对标准偏差在5%以内，且检测到的离子的相对丰度，用与最强离子（基峰）的强度百分比表示，应当与浓度相当的校正标准相对丰度一致，校正标准可以是校正标准品溶液，也可以是添加了标准物质的样品。基峰与次强碎片离子丰度比应符合表3要求。表3 基峰与次强碎片离子丰度比要求 相对丰度，%允许偏差，%50 20 2050 25 1020 30 10 50 6.4.3.2 定量方法 按6.4.1和6.4.2 设定仪器条件，待仪器稳定后，将混合标准工作液和样品制备液等体积进样测定，外标法定量。7 计算 DB37/T 17792011 4 试样中硝基呋喃类原药残留量按公式（1）计算，计算结果需扣除空白值，结果保留三位有效数字。mVX=.(1)式中：X样品中硝基呋喃类原药留量，单位为微克每千克（g/kg）；样品溶液中硝基呋喃类原药的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V样品最终定容体积，单位为毫升（mL）；m样品的质量，单位为克（g）。8 灵敏度 呋喃唑酮和呋喃它酮的检出限为0.20 g/kg、定量限为0.5 g/kg，呋喃西林和呋喃妥因的检出限0.5 g/kg、定量限为1.0 g/kg。9 准确度 本方法回收率为70%120%。10 精密度 本方法批内相对标准偏差10%，批间相对标准偏差15%。11 方法的线性范围 呋喃唑酮和呋喃它酮的线性范围：1.0 ng/mL100.0 ng/mL，呋喃西林和呋喃妥因的线性范围：2.0 ng/mL100.0 ng/mL。DB37/T 17792011 5 A A 附 录 A（资料性附录）色谱图 图A.1 四种硝基呋喃原药混合标准（10.0 ng/mL）质量色谱图 Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00%01.00 2.00 3.00 4.00 5.00%02009_0516-13 4:MRM of 2 Channels ES+225.8 138.73.11e52.982009_0516-13 4:MRM of 2 Channels ES+225.8 121.63.29e53.01Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00%21.00 2.00 3.00 4.00 5.00%22009_0516-13 1:MRM of 2 Channels ES-197 1243.33e32.880.82 4.35 4.02 3.072009_0516-13 1:MRM of 2 Channels ES-197 803.13e32.881.332.993.83 4.89 4.513.975.115.76Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00%31.00 2.00 3.00 4.00 5.00%12009_0516-13 2:MRM of 2 Channels ES-236.8 151.61.23e42.892009_0516-13 2:MRM of 2 Channels ES-236.8 123.62.03e32.910.070.72 1.263.814.684.44Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00%01.00 2.00 3.00 4.00 5.00%02009_0516-13 3:MRM of 2 Channels ES+325 2812.96e63.002009_0516-13 3:MRM of 2 Channels ES+325 251.92.31e63.00DB37/T 17792011 6 图A.2 空白样品质量色谱图 Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%50.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%22009_0516-28 2:MRM of 2 Channels ES-236.8 151.63172.971.480.350.211.070.920.730.501.332.782.37 2.071.661.96 2.262.604.884.543.793.723.163.383.984.354.135.29 5.145.445.635.922009_0516-28 2:MRM of 2 Channels ES-236.8 123.61693.052.712.191.85 1.511.07 0.060.800.690.470.351.25 1.962.072.492.372.865.445.063.493.383.274.994.133.943.724.394.625.185.555.77Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%40.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%01002009_0516-28 4:MRM of 2 Channels ES+225.8 138.71.24e35.203.102.802.020.560.41 0.340.970.821.91 1.081.571.27 1.722.622.212.432.924.633.29 4.52 3.364.003.894.414.155.014.755.385.645.832009_0516-28 4:MRM of 2 Channels ES+225.8 121.64040.115.272.620.261.680.371.16 0.451.010.520.601.352.212.021.762.283.102.803.213.853.443.743.63 4.074.154.674.524.905.125.765.385.64Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%01000.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%32009_0516-28 1:MRM of 2 Channels ES-197 1243500.980.050.350.200.460.761.731.581.501.171.393.902.181.923.342.852.252.59 3.193.604.274.164.984.684.465.845.695.175.542009_0516-28 1:MRM of 2 Channels ES-197 801715.355.214.532.850.980.830.420.200.500.682.591.131.731.211.432.442.101.953.933.522.963.073.373.754.354.084.644.835.095.955.435.50Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%50.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%22009_0516-28 2:MRM of 2 Channels ES-236.8 151.63172.971.480.350.211.070.920.730.501.332.782.37 2.071.661.96 2.262.604.884.543.793.723.163.383.984.354.135.29 5.145.445.635.922009_0516-28 2:MRM of 2 Channels ES-236.8 123.61693.052.712.191.85 1.511.07 0.060.800.690.470.351.25 1.962.072.492.372.865.445.063.493.383.274.994.133.943.724.394.625.185.555.77DB37/T 17792011 7 图A.3 加标样品（呋喃唑酮和呋喃它酮的添加量为 2.5 g/kg、呋喃西林和呋喃妥因的添加量为 5.0 g/kg）质量色谱图 _ Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%01000.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%02009_0516-29 3:MRM of 2 Channels ES+325 2817.89e32.831.300.593.95 3.135.672009_0516-29 3:MRM of 2 Channels ES+325 251.97.10e32.831.300.25 2.612.20 4.81 4.10Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%00.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%02009_0516-29 4:MRM of 2 Channels ES+225.8 138.71.38e42.995.202009_0516-29 4:MRM of 2 Channels ES+225.8 121.61.28e42.993.18Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%00.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%02009_0516-29 1:MRM of 2 Channels ES-197 1246.73e32.850.312009_0516-29 1:MRM of 2 Channels ES-197 806.44e32.892.96Time0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%10.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50%02009_0516-29 2:MRM of 2 Channels ES-236.8 151.61.05e42.904.472009_0516-29 2:MRM of 2 Channels ES-236.8 123.62.55e32.900.775.515.14 4.77 4.43