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ICS 07.100.30 B 20 备案号：DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 2052 2014 饲料中沙门氏菌测定 实时荧光 PCR方法 Determination of salmonella in feedstuffs Real-time PCR method 2014-02-28发布 2014-04-30实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2052 2014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、王伟、刘晓晖、赵立群、侯宇、柴竹林、张涛。DB22/T 2052 2014 1 饲料中沙门氏菌测定 实时荧光 PCR方法 1 范围 本标准规定了饲料中沙门氏菌的实时荧光 PCR检验方法。本标准适用于饲料中沙门氏菌的快速筛选检测。2 规范性引用文件 下 列文件对 于本 文件 的 应 用 是必不可少 的。凡是注日期 的 引 用 文件，仅所注日期 的 版 本适用于本 文 件。凡是不注日期 的 引 用 文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本 文件。GB/T 6682 分析 实验 室 用 水 规 格 和 试 验方法 GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的检验方法 GB/T 27403 实验 室 质量 控制 规 范 食 品 分子生物学 检测 3 术语和定义 下 列 术 语 和定 义 适用于本 文件。3.1 实时荧光 PCR real-time fluorescent PCR 实时荧光 聚合酶链式反应。3.2 Ct值 cycle threshold value 每个反应管内 的荧光 信号达到设 定的 阈值 时 所经历 的 循环数。4 原理 对样 品的 增 菌 培养物进行 DNA提 取，通过 实时荧光 PCR扩增，观察 实时荧光 PCR的 增幅曲线，从而 对 饲料中的沙门氏菌 进行 快速检测。5 试剂和培养基 除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为 按照 GB/T 6682规定的 一 级 水。所有试剂均 用 无 DNA酶 污染 的 容器 分 装。5.1 引物 及探针：a)上游 引物：5-GTGAAATAATCGCCACGTCGGGCAA-3 b)下 游 引物：5-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3 DB22/T 2052 2014 2 c)探针：5-FAM-TTATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTG TAMRA-3 5.2 Taq DNA聚合酶。5.3 dNTP：dATP（deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。5.4 细 菌 基因组 DNA提 取纯 化 试剂 盒。5.5 10 PCR缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L氯化钾（KCl），15 mmol/L氯化镁（MgCl2）。5.6 缓冲蛋白胨 水（BPW）：按 GB/T 13091中 附录 规定。5.7 沙门氏菌质 控 菌 株：来源 于 正 规菌 种保藏机构 的标准菌 株。如 CGMCC1.1859、CGMCC1.1194等。6 设备和材料 6.1 实时荧光 PCR仪。6.2 生物 安全柜：AII型。6.3 恒温 培养 箱。6.4 离 心 机：转 速 12 000 r/min。6.5 核酸蛋白 分析 仪或紫 外分 光光 度计。6.6 高压灭 菌 器。6.7 恒温 水 浴锅。6.8 天平：感 量 0.1g。6.9 移液器：0.2 L 2 L、2 L 10 L、20 L 200 L、100 L 1 000 L。6.10 均 质 器或乳钵。6.11 涡旋混 合 器。6.12 实时荧光 PCR反应管。6.13 离 心 管：1.5 mL。7 检测步骤 7.1 样品制备与增菌 参 照 GB/T 13091进行。7.2 模板 DNA的提取 取 BPW增 菌 液 1 mL于 1.5 mL无 菌 离 心 管 中，12 000 r/min离 心 5 min，尽 量 吸弃上清液，使 用 细 菌 基因组 DNA提 取试剂 盒 并按 其说明 提 取制 备模板 DNA。提 取 的 DNA溶液 可 于-20 保存。DNA提 取 和 纯 化 过 程 应 用 无 菌 水 作 为 核酸 提 取 空 白 对 照。7.3 DNA浓度测定 取 10 L DNA溶液 加 蒸馏 水 稀释至 1 mL，使 用 核酸蛋白仪或紫 外分 光光 度计 分别 检测 260 nm和 280 nm处 的 吸 光 值。DNA的 浓 度 按照 式（1）计 算，当 A260/A280比 值 在 1.52.1之间 时，适 宜 于 PCR扩增。扩 增 前将 所有样 品 DNA调至 10 ng/L50 ng/L。DB22/T 2052 2014 3 501000ANc=.(1)式 中：c DNA浓 度，单位 为 纳克 每 微升（ng/L）；A 260 nm处 的 吸 光 值；N 核酸 稀释倍 数。7.4 实时荧光 PCR检验 7.4.1 实时荧光 PCR反应体系 10 PCR缓冲液 2.5 L、引物对（10 mol/L）各 1 L、探针（10 mol/L）1 L、dNTP（10 mmol/L）1 L、Taq DNA聚合酶（5 U/L）0.5 L、模板 DNA 2 L、用 灭 菌 去 离 子水 补足体积至 25 L。7.4.2 实时荧光 PCR反应条件 94 预变性 2 min，94 变性 20 s，64 退火延伸 1 min，同 时 收集 FAM荧光，共 进行 40个循环。反应 产 物可 在 4 保存。不 同 仪器、不 同 Taq DNA聚合酶可 根据 要 求将 反应 条 件 做 适 当调整。检验 过 程 中 分别设 空 白 对 照、阴性 对 照、阳性 对 照。空 白 对 照 设为以 无 菌 水 代替 DNA模板；阴性对 照 采 用 非 沙门氏菌的 DNA作 为 实时荧光 PCR反应 的 模板；阳性 对 照 采 用沙门氏菌 DNA作 为 实时荧光PCR反应 的 模板。8 结果与判断 8.1 质量控制 空 白 对 照：无 扩增曲线，Ct值 40.0；阴性 对 照：无 扩增曲线，Ct值 40.0；阳性 对 照：出 现典 型 的 扩增曲线，Ct值应 35.0；否 则，视 为 无 效。8.2 结果判定 Ct值 40.0，可 判 定 样 品实时荧光 PCR结果 为 阴性。Ct值 35.0，可 判 定 该 样 品实时荧光 PCR结果 为 阳性，按 GB/T 13091进行 确证。35.0 Ct值 40.0，此 时 应 适 当 增 加 DNA模板 量 重做 实时荧光 PCR检测。重做结果 Ct值 40.0者 为 阴性，否 则实时荧光 PCR结果 为 阳性，按 GB/T 13091进行 确证。9 结果表述 9.1 实时荧光 PCR结果阴性，可 直接报告未 检出沙门氏菌。9.2 确证 试 验 结果 为 检出沙门氏菌，则 报告 检出沙门氏菌。9.3 确证 试 验 结果 为 未 检出沙门氏菌，则 报告未 检出沙门氏菌。10 生物安全措施 DB22/T 2052 2014 4 为 了 保 护 实验 室 人 员 的 安全，应 由 具 备 资 格 的工 作 人 员 检测沙门氏菌，所有培养物 和 废 弃 物应 小 心处置，并按 GB/T 27403中的 有 关 规定 执 行。11 废弃物处理和防止 污染 的措施 11.1 检验 过 程 中的 废 弃 物 需 经 121 高压灭 菌 处理至 少 30 min后再 弃 置。11.2 检验 过 程 中 防止交叉 污染 的 措施 按照 GB/T 27403执 行。_
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