皮革中动物源性成分检测 实时荧光PCR法DB22／T 2079-2014.pdf

ICS 59.140.20 B 45 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 2079 2014 皮革中动物源性成分检测 实时荧光 PCR法 Detection of animal-derived ingredients in leather by real time PCR method 2014-05-04发布 2014-06-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2079 2014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4给出的规则起草。本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国延边出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘金华，聂丹丹，刘韬，王玮琳，刘阳，吴连鹏，王宁，罗雁菲。DB22/T 2079 2014 1 皮革中动物源性成分检测 实时荧光 PCR法 1 范围 本标准规定了天然皮革中动物源性成分的定性检测方法。本标准适用于天然皮革牛、羊、猪成分的定性 PCR检测，不适用于再生革、人造革和合成革。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注 日期 的 引 用文件，仅所 注 日期 的 版 本适用于本文 件。凡是不注 日期 的 引 用文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本文件。GB/T 6682 分 析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法 3 原理 利 用 实时荧光 PCR技术，根据 不 同 物 种 的 特异 性 基因序 列对牛、羊、猪源性成分 进行鉴 定。利 用 CTAB裂解液破碎细胞，酚、三氯甲烷抽 提 蛋白质，异丙醇沉淀得到 DNA；以 提 取 的 DNA为模板进行实时荧光 PCR检测；通过特异 性 引 物和标 记荧光 物 质探针进行 牛、羊、猪源性成分的 实时荧光 PCR扩增，根据 PCR扩增 反 应中 每一个循环产 物 荧光信号 的 扩增曲线判 定，实现 对皮革中牛、羊、猪源性成分的定性分 析。4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合 GB T6682中二级水的要求。4.1 十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)。4.2 三羟甲基氨基甲烷 tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris。4.3 三氯甲烷(chloroform)。4.4 无水 乙 醇(absolute ethanol)。4.5 异丙醇(isopropyl alcohol)。4.6 75%乙 醇 溶 液：取 750 mL 无水 乙 醇，加 水 定 容至 1 L。4.7 乙二胺四乙酸钠盐（Na2EDTA）。4.8 苯 酚/三氯甲烷/异 戊 醇(25:24:1,体积比）。4.9 2X Real-time PCR预混 液。4.10 Tris-HCl：在 800 mL去离子 水 中 溶 解 121.1g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加 入 60 mL 浓盐酸，冷却至 室 温后调节 pH 值至 7.5，加 水 定 容至 1 L，分 装后 121高压灭菌 20min。4.11 1.2 mol/L 氯化 钠溶 液 4.12 CTAB裂解液：2 CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.02 mmol/L Na2-EDTA(pH 8.0)。4.13 TE 缓冲 液：配制 每 升 TE 缓冲 液，应 在 800 mL 水 中 依次加 入 1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)10 mL,O.5mol/L EDTA(pH8.0)2 mL，加 水 定 容至 1L，分 装后 121高压灭菌 20min。DB22/T 2079 2014 2 4.14 CTAB沉淀液：0.5 CTAB，0.04 mmol/L NaCl。4.15 蛋白 酶 k溶 液（20 mg/mL）4.16 引 物 及 探针序 列：天然皮革中牛、羊、猪 PCR 检测 引 物 信 息见表 1。表 1 牛、羊、猪 PCR检测引物信息 检测 基因 引 物 序 列 基因 性 质 适用 范围 哺乳 动物 特异基因 上游 引 物：5-AGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATG-3 下 游 引 物：5-TCCAGTATGCTTACCTTGTTACGA-3 探针：5-（FAM）-CGCACACACCGCCCGTCACCC-（TAMRA）-3 12S rRNA基因 皮革 及 其 加 工品 牛 内 源 基因 上游 引 物：5-CCGATGGATGTGTTCAGAGCT-3 下 游 引 物：5-GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3 探针：5-（FAM)-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA)-3 牛生 长素 基因 牛皮 及 其 加 工品 羊 内 源 基因 上游 引 物：5-ACACAACTTCTACCACAACCC-3 下 游 引 物：5-AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3 探针：5-(FAM)ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA-(TAMRA)-3 羊 线 粒体 ATPase 亚 基 羊皮 及 其 加 工品 猪 内 源 基因 上游 引 物：5-CATGCGTATCACCACCATTATATC-3 下 游 引 物：5-TGCCAAGCGGGTTGCT-3 探针：5-（FAM）-CGAGCTTAACTACCATGCCGCGTGA-(TAMRA)-3 猪 线 粒体 D-LOOP基因 猪皮 及 其 加 工品 5 仪器与设备 5.1 实时荧光 PCR检测 系统。5.2 高速冷冻离心机(12 000 r/min)。5.3 涡旋混 合 器。5.4 分 析 天 平：感量 0.01 g。5.5 微量移 液 器：0.1 L 2.5 L，1 L 10 L，2 L 20 L，10 L 100 L，20 L 200 L，100 L 1000 L。5.6 核酸 蛋白 分 析 仪或紫外 分 光光 度计。5.7 恒温 水 浴箱。5.8 湿热高压蒸汽灭菌器。5.9 解 剖刀。5.10 剪刀。6 试样处理 用 消毒 的 解 剖刀去除 皮 张 表 面 的 毛发 及 其 它附着 物，用 消毒 的 剪刀 将 皮 张 剪 成 1 mm3 大小 的 颗 粒。7 检验步骤 7.1 样品 DNA的提取 DB22/T 2079 2014 3 7.1.1 称 取 约 100 mg该颗 粒 置 于 2 mL 离心 管 中,以 去离子 水 振荡洗涤 三 次，10 000 r/min离心 5 min，倾 去上 层清 液。7.1.2 加 入 1.0 mL CTAB裂解液 及 50 L 蛋白 酶 K溶 液，涡旋 震荡 30 s后，颠倒 混 合 5 次，65 水 浴 过 夜（12h-16h）。7.1.3 室 温 12 000 r/min离心 10 min，取 上 层 溶 液 800 L，加 入 等 体积 的 Tris饱 和 酚/三氯甲烷/异 戊 醇（25:24:1，v/v/v），轻轻颠倒 离心 管 混 匀，室 温 12 000 r/min离心 10 min；取 上 层清 液(水 相)于 一新 离心 管 中，加 入 等 体积 的 三氯甲烷/异 戊 醇（24:1，v/v），颠倒 混 匀，室 温 12 000 r/min离心 10 min，取 上 清 液 600 L，加 入 2倍 体积 的 CTAB沉淀液，混 匀，室 温 静置 60 min。12 000 r/min离心 15 min，弃 上 清 液。加 入 500 L氯化 钠溶 液 溶 解沉淀，然 后加 入 500 L三氯甲烷，振荡 混 匀，12 000 r/min离心 10 min，将 上 清 液 移至 一新 离心 管，加 入 0.6倍 体积 的 异丙醇，混 匀，4 静置 30 min，4，12 000 r/min离心 10 min，小 心 弃 去上 清 液，向 沉淀 加 入 500 L 70%冷乙 醇，洗涤 沉淀，4，12 000 r/min离心 5 min，小 心 倒 出 上 清 液，室 温 干燥 后，将 DNA溶 于 50 L去离子 水 中，-20 保存。也 可 使 用 等效 的 商 品 化试 剂盒 提 取模板 DNA。7.2 DNA浓度和纯度的测定 取 5 L DNA溶 液 加二次蒸 馏 水 稀释 至 1 mL，使 用 核酸 蛋白 分 析 仪或紫外 分 光光 度计 分 别 检测 260 nm和 280 nm处 的 吸 光 值 A260和 A280。DNA的 浓度 按 式（1）计 算：100050=N Ac.(1)式 中：c DNA浓度，单位 为 微 克 每 微升（g/L）；A 260 nm处 的 吸 光 值；N 核酸 稀释倍数。注：当 A260/A280比值在 1.7 2.0之间 时，适 宜 于 PCR扩增。7.3 实时荧光 PCR检测 7.3.1 扩增试剂准备 为 确保 检测 结果 的准 确 性，在 进行 样 品 检测 时，应 设立空 白 对照、阴 性对照和阳性对照 实 验。实时荧光 PCR反 应 体系见表 2 表 2 实时荧光 PCR反应体系 试 剂 成分 体积 2 Real-time PCR预混 液 10 L 上游 引 物（10 mol/L）1 L 下 游 引 物(10 mol/L）1 L 探针(10 mol/L）1 L 样 品 DNA(1 100 ng/L)2 L 双 蒸 水 5 L 注 1：空 白 对照 实 验 时，用 双 蒸 水 替代样 品 DNA。注 2：阴 性对照 实 验 时，用 非目 标源性成分 但含 有 内 参 基因 的成分 替代样 品 DNA。注 3：阳性对照 实 验 时，用牛、羊、猪源性成分 DNA。DB22/T 2079 2014 4 实时荧光 PCR反 应 条 件 随 仪器 不 同 略 有改 变，一 般 为：95/10min，1个循环；95/20s，59/30s，72/30s，45个循环，在 每 次 循环 的 72/30s时 收集 荧光。检测 结果 后，根据扩增曲线 和 Ct值 判 定 结果。注：也 可用 等效 的牛、羊、猪、猫、狗 源性成分 实时荧光 PCR检测 试 剂盒 进行实时荧光 PCR检测。8 结果判 定 8.1 PCR有 效 性 判 定 空 白 对照：无 FAM荧光信号，相 应 Ct值 40。阴 性对照：无 FAM荧光信号，相 应 Ct值 40。阳性对照：有 FAM荧光信号，且 FAM通 道 出 现 明显 的 扩增曲线，Ct值 36。否 则 判 定 为 PCR无 效。8.2 检测 结果判 定 待 测 样 品 牛/羊/猪源性 基因 检测 Ct值 大 于 或 等 于 40，内 参 照 基因 检测 Ct值在 20 35之间 者，阴 性对 照、阳性对照和 空 白 对照 结果 正常者，则可 判 定 该样 品 未 检出牛、羊、猪源性成分。待 测 样 品 牛/羊/猪源性 基因 检测 Ct值 小 于 40，内 参 照 基因 检测 Ct值在 20 35之间 者，阴 性对照、阳性对照和 空 白 对照 结果 正常者，则可 判 定 该样 品 检出牛、羊、猪源性成分。待 测 样 品 牛/羊/猪源性 基因 检测 Ct值在 36 40之间，应 重做 实时荧光 PCR扩增。再 次 扩增 后 的 结果 Ct值 仍 小 于 40者，且阴 性对照、阳性对照和 空 白 对照 结果 正常，则可 判 定 该样 品 检出牛、羊、猪源性成分；再 次 扩增 后 结果 Ct值 大 于 40，且阴 性对照、阳性对照和 空 白 对照 结果 正常，可 判 定 该样 品 未 检出牛、羊、猪源性成分。_