萝卜抗黑腐病种质鉴定技术规程DB42／T 1106-2015.pdf

ICS 65.020.20 B31 备案号：DB42 湖北省 地 方 标 准 DB 42/T 1106 2015 萝卜抗黑 腐病种质 鉴定技术 规程 Rules for evaluation of radish germplasm for resistance to black rot（报批 稿）2015-10-30 发布 2015-12-18 实施 湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB42/T 1106 2015 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语与 定义.1 4 接 种体 制备.2 5 室 内抗 性鉴 定技 术.2 6 田 间接 种鉴 定.3 7 病 情调 查.3 8 抗 性评 价标 准.4 附录A（资 料性 附录）萝卜黑 腐病 病原 菌.5 DB42/T 1106 2015 II 前 言 本标准 按 照GB/T 1.1-2009 标准 化工 作导 则 第1部 分：标 准的 结构 和编 写 给 出的 规则 起草。本标准 由湖 北省 农业 科学 院提出。本标准 由湖 北省 农业 科学 院归口 管理。本标准 起草 单位：湖 北省 农业科 学院 经济 作物 研究 所。本标准主要起草人：甘彩 霞、袁 伟玲、邓 晓辉、崔 磊、王 晴芳。DB42/T 1106 2015 1 萝 卜抗黑 腐病种质 鉴定技 术规程 1 范围 本标准 规定 了萝 卜（Raphanus sativus L.）抗黑 腐病（Xanthomonas campestris pv.Campestris(Pammel)Dowson）抗性种质鉴定技 术中的 术语与定义、接种 体制备、室内抗性鉴定技 术、田间接种鉴定、病情调查 及 抗性 评价 标准。本标准 适用 于湖 北地 区萝 卜抗黑 腐病 抗性 的室 内鉴 定及评 价。2 规范性 引用 文件 下列文 件对于 本文 件的应 用是必 不可少 的。凡是注 日期的 引用文 件，仅所注 日期的 版本适 用于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。NY/T 1857.6-2010 黄瓜 主要病 害抗 病性 鉴定 技术 规程 第 6 部分：黄 瓜抗 细 菌性角 斑病 鉴定 技术 规程 NY/T 1858.4-2010 番茄 主要病 害抗 病性 鉴定 技术 规程 第4 部分：番 茄抗 青枯病 鉴定 技术 规程 NY/T 2060.2-2011 辣椒 抗病性 鉴定 技术 规程 第2 部分：辣椒 抗青 枯病 鉴定 技术规 程 3 术语与 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 抗病性 disease resistance 植物体 所 具 有的 能够 减轻 或克服 病原 物致 病作 用的 可遗传 特性。3.2 抗病性 鉴定 identification of disease resistance 通过适 宜技 术方 法鉴 定植 物对特 定病 害的 抵抗 水平。3.3 抗性评 价 evaluation of resistance levels 根据采 用的 技术 标准 判别 植物对 特定 病害 反应 程度 和抵抗 水平 的描 述。3.4 致病性 pathogenicity 病原物 所具 有的 破坏 寄主 和引起 病变 的能 力。3.5 人工接 种 artificial inoculation 在适宜 条件 下，通过 人工 操作将 接种 体置 于植 物体 适当部 位并 使之 发病 的过 程。3.6 病情级 别 disease rating scale 人为定 量植 物个 体或 群体 发病程 度的 数值 化描 述。3.7 病原物 分离 pathogenic isolation DB42/T 1106 2015 2 采用人 工方 法从 植物 发病 部位分 离获 得的 在特 定环 境条件 下培 养的 病原 物。3.8 培养基 culture medium 可以使 病原 物生 长的 自然 或人工 配制 的基 质。3.9 接种体 inoculum 用于接 种以 引起 病害 的病 原物或 病原 物的 一部 分。3.10 接种悬 浮液 inoculum suspension 用于接 种的 含有 定量 接种 体的液 体。3.11 病情指 数 disease index(DI)通过对 植物 个体 发病 程度（病情 级别）数 值的 计算 所获得 的群 体发 病程 度的 数值化 描述 形式。4 接种体 制备 4.1 病原物 分离 从黑腐 病侵 染发 病 形 成典 型“V”字 形病 斑的 植株 上 采集分 离病 原物(2012 年 采 集于湖 北省 武汉 市武湖地区)，采用 稀释 平板 涂 布法，挑取 单菌 落保 存，并按柯 赫氏 法则 进行 验证，得到 纯培 养，放入4 冰箱中保 存备 用。采用Biolog 系统 与16S rDNA 序列 分析,结果 一致,相 互 得到了 验证。确定 获得 油 菜黄单 胞杆 菌油 菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris(Pammel)Dowson）菌 株，保存 备用。4.2 接种体 繁殖 将黑腐 病菌 种接 种前 用NYGB(蛋白 胨5.0g,酵母 粉3.0g,甘油20.0g，1000ml)液 体培养 基进 行培 养，200r/min，24h，28。萝 卜黑腐 病接 种浓 度OD600=0.1(108cfu ml-1)。4.3 菌种保 存 甘油斜 面保 存法：将NYGA(蛋白 胨5.0g,酵 母粉3.0g,甘油20.0g，琼 脂17g,1000ml)固体培 养基 做成试管斜面,挑取 病原菌 菌落 划 线，生 长出菌 落后 三天可 加入30%-50%甘油 或者纯 甘 油保存，保存 于-20 冰柜可存 活2 年3年，温 度越 低存活 期越 长，超低 温冰 箱可存 活3 年5 年。5 室内抗 性鉴 定技 术 5.1 鉴定室 设置 人工接 种鉴 定室 应具 备人 工调节 温度、湿 度及 光照 的条件，使 人工 接种 后具 备良好 的发 病环 境。5.2 鉴定对 照 鉴定时 设“雪单 一号”萝 卜为抗 病对 照品 种，耐热 板叶萝 卜“短叶13”为 感 病对照 品种。每 接种 材料设置 清水 接种 为对 照。5.3 鉴定设 计 鉴定材 料随 机或 顺序 排列，每份 材料 重复3次，每 重 复10株苗。5.4 鉴定材 料育 苗 鉴定材 料种子经5%次氯酸 钠溶液 浸种10min 后，用 清 水冲洗，放入 垫有 两层滤 纸的培 养皿中，然 后于恒温 培养箱 中28 催芽。待胚 根长至0.5cm 时，将 其播于 装有基 质的 育苗盘 中，育 苗基质 为草 炭、有机肥和 菜田土（2:1:1），基质经 高温蒸 汽灭 菌（120，30min）。在25 30 的日 光温室 内育 苗，幼苗应 生长 健壮、一 致。5.5 接种方 法 5.5.1 接种时 期 DB42/T 1106 2015 3 萝卜黑 腐病 抗性 鉴定 接种 期 为5 叶期 6叶 期。5.5.2 接种浓 度 5.0 107cfu/mL 1.0 108cfu/mL。5.5.3 接种方 法 采用喷 雾方法 进行。用小 型喷雾 器（工农-16 型电 动 喷雾器）将接 种物 喷洒到 植株上 至叶片 正反 两面湿润 而不 下滴，设 置清 水接种 为对 照，接种 后保 湿24 h，湿 度保 持在90%95%。6 田间接 种鉴 定 长江中 下游 地区 于春 季4 月 上中旬 播种，5 月上 中旬 选 择雨后 湿度 较大 的晴 天接 种，接 种后 搭小 拱棚进行保 湿24 h，设置 清水 接种为 对照。7 病情调查 7.1 调查时 间 接种后7d调 查病 情。7.2 病情分 级 室内病 情分 级及 其对 应的 症状描 述见 表1。表1 萝 卜黑 腐病 病情 级别 划分 病情级 别 症状描 述 0 无症状 0.5 叶上有 一个 小斑 1 叶上有 几个 病斑 或一 个较 大的病 斑 3 叶上发 病区 小于 叶面 积的10%5 叶上发 病区 占叶 面积 的11%25%7 叶上发 病区 占叶 面积 的26%50%9 叶上发 病区 大于 叶面 积的51%7.3 病情指数 调 查方 法 调查每 份鉴 定材 料接 种叶 发病情 况，根 据病 害症 状 描述，逐 份材 料整 株每 片 叶进行 调查，记载 病情级别，计算 出病 情指 数(DI)。病情 指数 按公 式（1）计 算：式中：DI 病情 指数；s 各 病情 级别 代表 数值；n 各病 情级 别病 株（叶）数；N 调查 总株（叶）数；S 最高 病情 级别 代 表值。(s n)DI=100.(1)N S DB42/T 1106 2015 4 8 抗性评 价标 准 依据鉴 定材 料的 发病 程度（病情 指数）确 定其 对萝 卜黑腐 病的 抗性 水平，划 分标准 见 表2。表2 萝 卜黑 腐病 抗性 评价 标准 病情指 数 抗性评 价 0 免疫（I）0 DI 10 高抗（HR）10 DI 20 抗病（R）20 DI 40 中抗（MR）40 DI 60 感病（S）DI60 高感（HS）DB42/T 1106 2015 5 A A 附 录 A（资料 性附 录）萝卜黑 腐病 病原 菌 A.1 学名 油菜黄 单胞 杆菌 油菜 致病 变种（Xanthomonas campestris pv.campestris(Pammel)Dowson）。A.2 形 态 描 述 病原细 菌短 杆状，（0.40.5）（0.7 3.0）L，单根鞭 毛，极生，有 荚膜，无芽 孢。革兰 氏染色阴性 反应，好 气性。在 牛肉膏 琼脂 培养 基上 菌落 呈圆形，初 呈淡 黄色，后 呈蜡黄 色，表面 有光 泽，但不粘滑。在 马铃 薯培 养基 上，菌 落呈 深厚 的黄 色粘 稠状。A.3 为 害 部 位 及 症 状 可危害 萝卜 叶和根。该 病 多从叶 缘向内 扩展，形成 典型的“V”字形黄 褐色 枯 斑，叶 脉变黑，叶缘变黄，后 扩及 全叶；根 部受侵 染时，病 原菌 沿髓 部维管 束侵 染，萝卜 中部 腐烂变 黑形 成中 空，雨 过 天晴后，易干 枯掉 根部 染病 后，导 管变 黑，内部 组织 干腐，外观 往往 看不 出明 显症状，但 髓部 多 成 黑 色 干腐状，后形 成空 洞。田间 多 并发软 腐病，终 成腐 烂状。在高山 菜区 山峰 之间 地势 较低洼 的萝 卜生 产田 间，昼夜温 差大、降 雨量 充沛 时，黑腐 病容 易爆 发；平原 地 区特别 是长 江中 下游 地区 萝卜多 以秋 冬类 型为 主，该病多 从叶 缘侵 染普 遍发 病。A.4 鉴定 记载 表 萝卜黑 腐病 鉴定 结果 记载 见样表。表A.4 萝 卜黑 腐病 鉴定 结 果记载 样表 编号 品种名称 来源 病情级别 病情指数 平均病指 抗性评价 0 级 0.5 级 1 级 3 级 5 级 7 级 9 级 备注：1.播种日期：2.接种日 期：3.接种生育期：4.接种病 原菌分离物编号：5.调查日期：鉴定技 术负 责人（签 字）：_