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ICS 65.020.30 B45 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3316 2018 鸡 J-亚群白血病实验室诊断技术 Laboratary Diagnostic Technique of Chicken Leukosis Virus Subgroup J(ALV-J)2018-06-12 发布 2018-07-12 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 3316 2018 I 前 言 GB/T 1.1-2009 DB37/T 3316 2018 1 鸡 J-亚群白血病实验室诊断技术 1 范围 ALV-J J 2 术语和定义 2.1 禽白血病病 毒J 亚群 Avian Leukosis Virus Subgroup J.ALV-J ALV-J RNA ALV-J 2.2 抗原/抗体检 测 enzyme linked immunosorbent assay ELISA ALV-J/ALV-J/ALV-J ALV-J p27 GB/T 26436 p27 ALV-J 2.3 PCR(Polymerase Chain Reaction,PCR)2.4 RT-PCR-reverse transcription PCR RT-PCR 3 材料与试剂 3.1 ELISA/(IDEXX)3.2 RNA 3.3 RNA 3.4 3.4.1 PBS A A.1 3.4.2 DB37/T 3316 2018 2 3.4.3 3.4.4 A A.2 3.4.5 A A.3 4 仪器与设备 4.1(105-134 0.23Mpa)4.2 4.3 PCR 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 5 抽样 5.1 样品采集 5.1.1 组织样品的 采集 1%J 100 mg 1 mL-80 5.1.2 血液样品的 采集 2.5 mL 1 mL-20 5.1.3 泄殖腔棉拭 子的采集 1 mL PBS-20 5.2 样品运输与 存放-80-20 6 操作方法 6.1 方法 DB37/T 3316 2018 3 6.1.1 抗原/抗体检 测/IDEXX ELISA 6.1.1.1 样品处理 2 3 4 1006.2 g 3000 2 min 3 min 500 6.1.1.2 操作步骤 6.1.1.3 结果判定 p27 ALV-J 6.1.2 RT-PCR 检测 RNA cDNA PCR 6.1.2.1 RNA 及 cDNA 提取 RNA cDNA RNA-80 cDNA-20 6.1.2.2 操作步骤 RNA RNA cDNA cDNA ALV-J gp85 PCR 120 V 1%RNA-80 cDNA-20 B 6.1.2.3 结果判定 545 bp 6.1.3 病毒分离 6.1.3.1 DF-1 细胞传代培 养 DF-1 4 60%70%6.1.3.2 组织研磨液 制备/DMEM 90 3 2 1006.2 g 3 min 0.22 m 6.1.3.3 病毒液感作 DF-1 细胞 4 h DF-1 1mL/DF-1 1h 7 DB37/T 3316 2018 4 6.1.3.4 p27 抗原检测 IDEXX ELISA 6.1.3.5 结果判定 p27 ALV-J 6.1.4 结果诊断 RT-PCR DF-1 p27 ALV-J DB37/T 3316 2018 5 A A 附 录 A（规范性附 录）材料与试剂 配制方法 A.1 PBS 缓冲液 NaCl 8 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.42 g Na2HPO4 12H2O 3.58 g KH204 0.27 g 1000 mL A.2 细胞生长培 养基 Dulbeccos Minimum Essential Medium DMEM 1 NaHCO3 3.7 g 10 mL 100 mL 1000 mL 4 A.3 细胞维持培 养基 Dulbeccos Minimum Essential Medium DMEM 1 NaHCO3 3.7 g 10 mL 10 mL 1000 mL 4 DB37/T 3316 2018 6 B B 附 录 B（规范性附 录）RT-PCR 引物信息 J ALV-J RT-PCR 10 pmol 5-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3 545bp J ALV-J gp-85 gp-85 5-CGAACCAAAGGTAACACACG-3 DB37/T 3316 2018 7 C C 附 录 C（规范性附 录）RT-PCR 反应条件 C.1 20 L PCR 5X Prime Script Master Mix 4 L,RNA x L x=1000/RNA RNase Free dH2O 20 L C.2 37 15 min 85 5 s C.3 PCR 25 L PCR,2 Tap PCR MasterMix12.5 L 10 pmol/L 0.5 L cDNA1 L 25 L C.4 95 5 min 94 30 s 53 30 s 72 45 s 30 72 10 min 4 PCR 7 L 8 L 2%图C.1 PCR 扩增电泳结果（N 为阴性对 照）_
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