牦牛源沙门氏菌分离鉴定技术规范DB51／T 1836-2014.pdf

ICS 65.020.30 B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 18362014 牦牛源沙门氏菌分离鉴定技术规范 2014-09-19发布 2014-10-01实施四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 18362014 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 设备和试剂.2 5 分离培养.3 6 生化试验.4 7 PCR鉴定.4 8 报告结果的表示.5 9 废弃物无害化处理.5 附录 A（规范性附录）相关试剂配制.6 DB51/T 18362014 II 前 言 本标准附录A为规范性附录。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准发布。本标准起草单位：西南民族大学。本标准主要起草人：张焕容、汤承、岳华、杨发龙、王永、张斌、任玉鹏、王远微。DB51/T 18362014 1 牦牛源沙门氏菌分离鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了牦牛源沙门氏菌的分离鉴定方法。本标准适用于牦牛源沙门氏菌的分离及鉴定和牦牛沙门氏菌病的诊断。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程。兽医实验室生物安全技术管理规范（2003农业部公告第302号）。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 沙门氏菌属 salmonella 是一群寄生于人和动物肠道内的革兰阴性杆菌，生化特性和抗原结构相似，兼性厌氧。绝大多数发酵葡萄糖产酸产气，也偶尔有不产气的。在三糖铁琼脂上常产生 H2S。3.2 牦牛源沙门氏菌 salmonella in Yak 是指从牦牛实质器官、粪便和肉品中分离鉴定的沙门氏菌，包括致病性和非致病性沙门氏菌。致病性沙门氏菌常引起犊牦牛副伤寒，犊牦牛或青年牦牛急性胃肠炎和败血症及其他组织局部炎症。且为人类食物中毒的主要病原之一。4 设备和试剂 4.1 主要仪器设备 4.1.1 CO2 培养箱 4.1.2 移液器(0.1L 10L、2L 20L、20L 200L、200L 1000L)。4.1.3 离心机 4.1.4 无菌工作台 DB51/T 18362014 2 4.1.5 4 PCR 扩增仪 4.1.6 电泳仪、水平电泳槽 4.2 培养基和试剂(见附录 A)4.2.1 缓冲蛋白胨水(BPW)4.2.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液 4.2.3 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂 4.2.4 SS 培养基 4.2.5 麦康凯培养基(MaCC)4.2.6 三糖铁(TSI)琼脂 4.2.7 赖氨酸脱羧酶试验培养基 4.3 PCR鉴定相关试剂 4.3.1 引物（10 mol/L）上游引物：5-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3 下游引物：5-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3。4.3.2 扩增目的片段大小为 284 bp。4.3.3 DNA 提取试剂：蛋白酶 K、十二烷基硫酸钠（SDS）、Tris 饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇。4.3.4 PCR 反应试剂：Taq DNA 聚合酶（5 U/L）、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（每种浓度为 2.5 mmol/L）、10PCR Buffer(无Mg2+)。4.3.5 STE 缓冲液(见附录 A)4.3.6 TAE 电泳缓冲液(见附录A)4.3.7 6上样缓冲液(6Loading Buffer)4.3.8 琼脂糖(电泳级)4.3.9 核酸染料(Goldview)4.3.10 DNA 分子量标准 DL600。4.3.11 水：所用水应符合 GB/T 6682 中三级水（三蒸水）规格。4.3.12 阳性对照：标准参考毒株作为阳性对照。4.3.13 阴性对照：用 GB/T 6682 中三级水代替 PCR 扩增模板作为阴性对照。5 分离培养 5.1 样品的采集 无菌采取牦牛粪便、肉品或实质器官棉拭子。5.2 预增菌 把采集的棉拭子置于 10 mL BPW 增菌液于 361 培养 8 h18 h。5.3 增菌 取 1 mL预增菌液转种于10 mL TTB 增菌液内，于 421 培养 18 h24 h。DB51/T 18362014 3 5.4 分离培养 分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于 SS 琼脂平板和 XLD 平板于 361 培养 18 h24 h 观察各个平板上生长的菌落,挑取 SS 平板上灰白色、半透明、圆珠状、边缘整齐、光滑湿润、中心黑色，中等大小的菌落 35 个或透明，针尖大小的菌落，和 XLD 平板上呈粉红色，带或不带黑色中心的菌落 35 个，经革兰氏染色镜检。然后将 SS 平板和 XLD 平板上 G-的菌落分别划线接种于麦康凯平板上，于 361 培养 18 h24 h，观察麦康凯平板上生长的菌落，挑取 35 个细小无色菌落，划线接种于 SS 琼脂平板，361 培养 24 h 进一步纯化。6 生化试验 自 SS 琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 361 培养 18 h24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表 1。表1 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 斜面 底层 产气 硫化氢 赖氨酸脱羧酶试验培养基 初步判断 K A（）（）可疑沙门氏菌属 K A（）（）可疑沙门氏菌属 A A（）（）可疑沙门氏菌属 A A/非沙门氏菌 K K/非沙门氏菌 注：K：产碱，A：产酸；：阳性，：阴性；（）：多数阳性，少数阴性；/：阳性或阴性。7 PCR 鉴定 7.1 DNA 提取 7.1.1 固体培养基上的菌落用接种环钩取后用于 DNA 提取，液体培养基中的培养物经 12000 r/min 离心 20 min,弃上清，收集沉淀用于 DNA 提取。向沉淀中加入 500 L STE 缓冲液，振荡重悬。7.1.2 加入 10%SDS 溶液 20 L，20 mg/mL 蛋白酶 K 10 L，混匀，在 56 水浴 60 min。7.1.3 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），混匀，12000 r/min 离心 5 min。7.1.4 转移上清到另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000 r/min 离心 5 min。DB51/T 18362014 4 7.1.5 取上清，加入 2.5 倍体积的预冷无水乙醇，-20 沉淀 30 min，12000 r/min 离心 5 min，弃去上清液。7.1.6 用 1 mL 70%乙醇漂洗，12000 r/min 离心 5 min，重复 2 次3 次。7.1.7 室温干燥，DNA 沉淀用 25 L 无菌三蒸水溶解作为模板，-20保存备用。7.1.8 对照样本 DNA 提取与检测样本处理方法相同。7.2 PCR 扩增 7.2.1 每次进行 PCR 扩增时，除检测样品外，均需设置阳性和阴性对照。7.2.2 PCR 反应总反应体系 25 L，包括以下成份：10 PCR Buffer 2.0 L，10 mmol/L dNTPs 2.5 L，Taq 酶 0.5 L，模板DNA1 L，上引物 1 L，下引物 1 L，水17 L，总体积 25 L。7.2.3 PCR 反应条件为 94预变性5 min；94变性45 s，60 退火45s，72 延伸30 s，共30个循环；72 延伸 10 min；反应完毕 4保存。7.3 PCR产物的电泳检测 7.3.1 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 A）。7.3.2 取5 L PCR产物与1 L 6上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在另一加样孔中加入 DNA分子量标准 DL600，以 5 V/cm 恒压电泳，采用凝胶成像系统进行判定核酸片段大小。阳性对照出现一条 284 bp 大小的条带，阴性对照不出现条带。8 报告结果的表示 8.1 阳性结果 菌落形态和革兰染色特性、生化特性符合沙门氏菌特征，以及 PCR 检测出目的大小的核酸片段，判定为从牦牛样品中分离鉴定出沙门氏菌。8.2 阴性结果 菌落形态和革兰染色特性、生化特性不符合沙门氏菌特征，且 PCR 未检测出目的大小的核酸片段，判定为从牦牛样品中未分离鉴定出沙门氏菌。9 废弃物无害化处理 按GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程处理。废弃物实行无害化处理。DB51/T 18362014 5 A A 附 录 A（规范性附录）相关试剂配制 A.1 缓冲蛋白胨水（BPW）A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠（含12 个结晶水）9.0 g 磷酸二氢钾 1.5 g 蒸馏水 1 0 00 m L pH 7.20.2 A.1.2 制法 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121 15min。A.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液 A.2.1 基础液 蛋白胨 1 0.0 g 牛肉膏 5.0 g 氯化钠 3.0 g 碳酸钙 4 5.0 g 蒸馏水 1 00 0 m L pH 7.00.2 除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节 pH，高压灭 121，20 min。A.2.2 硫代硫酸钠溶液 硫代硫酸钠（含5个结晶水）50.0 g 蒸馏水 加至 100 mL 高压灭菌121，20 min。A.2.3 碘溶液 碘 片 20.0 g 碘化钾 25.0 g 蒸馏水 加至100 mL 将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水DB51/T 18362014 6 至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。A.2.4 0.5%煌绿水溶液 煌绿 0.5 g 蒸馏水 1 00 m L 溶解后，存放暗处，不少于1d，使其自然灭菌。A.2.5 牛胆盐溶液 牛胆盐 10.0 g 蒸馏水 1 00 m L 加热煮沸至完全溶解，高压灭菌 121，20 min。A.2.6 制法 基础液 90 0 m L 硫代硫酸钠溶液 1 00 m L 碘溶液 20.0 m L 煌绿水溶液 2.0 m L 牛胆盐溶液 50.0 m L 临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。A.3 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂 A.3.1 成分 酵母膏 3.0 g L-赖氨酸 5.0 g 木糖 3.75 g 乳糖 7.5 g 蔗糖 7.5 g 去氧胆酸钠 2.5 g 柠檬酸铁铵 0.8 g 硫代硫酸钠 6.8 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 1 5.0 g 酚红 0.08 g 蒸馏水 1 00 0 m L pH 7.40.2 A.3.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入 600 mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至 50 55 倾注平皿。DB51/T 18362014 7 注:本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。A.4 麦康凯培养基(MaCC)A.4.1 成分 蛋白胨 17 g 脙胨 3 g 猪胆盐(或牛、羊胆盐)5 g 氯化钠 5 g 琼脂 17 g 蒸馏水 10 00 m L 乳糖 1 0 g 0.0 1%结晶紫水溶液 1 0 m L 0.5%中性红水溶液 5 m L A.4.2 制法 将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于 400mL 蒸馏水中，校正 pH7.2。将琼脂加入 600 mL 加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121 高压灭菌 15min 备用。临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至 50 55 时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。注：结晶紫及中性红水溶液配好后须经 121 高压灭菌 15min。A.5 SS琼脂培养基 A.5.1 成分 胨 5 g 硫代硫酸钠 8.5 g 牛肉浸出粉 5 g 1%中性红溶液 2.5 m L 乳糖 10 g 0.1%亮绿溶液 0.33 m L 牛胆盐 8.5 g 琼脂 20 g 枸橼酚钠 8.5 g 水 1000 mL 枸橼酸铁铵 1 g A.5.2 制法 除糖、指示剂、琼脂外，取上述成分混合，加热使溶解，调节 pH值使灭菌后为 7.2 0.1，滤过，加入琼脂，加热融化后，121 灭菌 20 分钟，再加入其余成分，摇匀，冷至约 60，倾注平皿。DB51/T 18362014 8 A.6 三糖铁（TSI）琼脂 A.6.1 成分 蛋白胨 2 0.0 g 牛肉膏 5.0 g 乳 糖 1 0.0 g 蔗 糖 1 0.0 g 葡萄糖 1.0 g 硫酸亚铁铵（含 6 个结晶水）0.2 g 酚 红 0.0 2 5 g 或 5.0 g/L 溶液 5.0 mL 氯化钠 5.0 g 硫代硫酸钠 0.2 g 琼 脂 1 2.0 g 蒸馏水 1 00 0 m L pH 7.40.2 A.6.2 制法 除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，调节 pH。另将琼脂加入 600 mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约 2 mL4 mL，高 压 灭 菌121 10 min 或115 15 min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。A.7 赖氨酸脱羧酶试验培养基 A.7.1 成分 蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 葡萄糖 1.0 g 蒸馏水 1 0 00 m L 1.6溴甲酚紫-乙醇溶液 1.0 m L L-赖氨酸或 DL-赖氨酸 0.5 g/100 mL 或 1.0 g/100 mL pH 6.80.2 A.7.2 制法 除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶 100 mL，分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按 0.5加入，DL-赖氨酸按 1加入。调节 pH。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内，每管 0.5 mL，上面滴加一层液体石蜡，115 高压灭菌 10 min。A.8 试验方法 从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36 1 培养 18 h24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。DB51/T 18362014 9 A.8.1 STE缓冲液 0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L Tris.HCl(pH8.0)1 mmol/L EDTA(pH8.0)A.8.2 TAE电泳缓冲液（pH8.0）50TAE 电泳缓冲液贮存液：Tris 碱 242 g EDTA 37.2 g 冰乙酸 57.1 mL 加双蒸水至 1000 mL，应用前用双蒸水将 50TAE 电泳缓冲液进行 50 倍稀释。A.8.3 2%的琼脂糖电泳凝胶板制备 琼脂糖 2g 1TAE电泳缓冲液 100 mL 将琼脂糖放入 TAE 电泳缓冲液中，加热融化，温度降至 60 左右时加入 5 L 的核酸染料，混匀，均匀倒板，厚度为 3 mm5 mm。_ DB51/T 18362014