家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒的测定 RT-PCR法DB22／T 2010-2014.pdf

ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 2010 2014 家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒的测定 RT-PCR法 Detection of Hepatitis E virus by RT-PCR in Livestock（pig/cattle/sheep）2014-02-28发布 2014-04-30实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2010 2014 1 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准主要起草人：苏双、邵洪泽、许志林、程荣华、王楠、李琳、毛文智、王忠国、李文东，于丹。DB22/T 2010 2014 2 家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒的测定 RT-PCR法 警告使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒 RT-PCR测定方法。本标准适用于猪、牛、羊等家畜戊型肝炎病毒的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是 注日期 的 引 用文件，仅所注日期 的 版 本适用于本文 件。凡是不 注日期 的 引 用文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室 用 水 规 格 和 试验 方法 3 术语和定义 下列 术语 和定 义 适用于本文件。3.1 戊型肝炎病毒 Hepatitis E virus HEV 戊型肝炎病毒科 成员。一种 单 股正链 RNA病毒，呈球形、直径 27 34 nm，无囊膜，核衣壳呈二十 面体立体 对 称。病毒 基因组长约 7.2 knt，有 3个开放阅读框（ORF1、ORF2、ORF3）。ORF2位于 3端，为 主要的 结构基因编码区，可 编码核衣壳蛋白。3.2 聚合酶 链反 应 polymerase chain reaction PCR 聚合酶链反 应（PCR）技术 是 一种在体外快速扩增特 定 DNA片段 的方法。由 热变性 复性 延伸 三步反 应 组成一个 PCR循环，经 过多次 循环反 应，使目 的 DNA得以大量 扩增。3.3 反转录 reverse transcription RT 反 转录（RT）是 以 RNA为 模板 合成 互补 DNA（cDNA）的 过 程。4 试剂与材料 4.1 引 物 DB22/T 2010 2014 3 引 物序 列 见表 1，引 物浓度 为 25 mmol/L。表 1 特异 性引 物序列 引 物 种 类 引 物名 称 特 异 性引 物 的 核 苷酸序 列 扩增片段长 度（bp）外引 物 HEV-1 5-TAY CGH AAY CAA GGH TGG CG-3（第 1次 PCR引 物）HEV-2 5-TGY TGG TTR TCR TAR TCC TG-3 524 内 引 物 HEV-3 5-ATW CAT GGV TCR CCT GTG AA-3（第 2次 PCR引 物）HEV-4 5-AAA TYA ATT CTG TCG GRA GC-3 328 注：R=A/G，Y=C/T，W=A/T，H=A/C/T，V=A/C/G。4.2 试剂 4.2.1 RNA提 取 试剂盒 4.2.2 RT-PCR试剂盒 4.2.3 DNA分子 质量标准（DNA Marker）DNA分 子质量 标准可 采 用 100 bp DNA ladder Maker、DNA Marker DL 2 000或 其 它 等 效产品。4.2.4 其它试剂 4.2.4.1 双 蒸 水：符 合 GB/T 6682中 4.2二 级 水 要 求；4.2.4.2 0.1%DEPC水：见附录 A中 A.1；4.2.4.3 75%无水 乙醇：见附录 A中 A.2；4.2.4.4 10 mg/mL溴化乙锭（EB）或 其 替代品：见附录 A中 A.3；4.2.4.5 凝胶加样缓冲液：见附录 A中 A.4；4.2.4.6 1倍 Tris-硼酸电泳缓冲液：见附录 A中 A.5；4.2.4.7 灭菌 1 mol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS）：见附录 A中 A.6。4.3 材料 4.3.1 一 次 性无 菌手套或乳胶手套；4.3.2 1.5 mL离心 管；4.3.3 0.2 mL PCR反 应管；4.3.4 琼脂糖；4.3.5 500 mL量筒；4.3.6 500 mL锥 形 瓶；4.3.7 吸头；4.3.8 眼 科 剪；4.3.9 眼 科 镊；4.3.10 称 量纸。5 仪器设备 5.1 PCR仪；5.2 电泳仪；DB22/T 2010 2014 4 5.3 电泳槽；5.4 紫 外 光透射仪或凝胶 成 像系统；5.5 高 速 台式冷 冻 离心 机：12 000 r/min；5.6 微 型 高 速 离心 机：12 000 r/min；5.7 水 浴锅：30-100；5.8 分析 天平：感 量 0.1 g；5.9 微波炉；5.10-20冰箱；5.11 旋涡振荡器；5.12 乳 钵 或 玻璃 研 磨器；5.13 微 量 移 液 器。6 样品 的采 集及处理 6.1 肝 脏样品 的采 集及处理 采 取 肝 脏 样品 约 1.02.0 g，置 于 灭菌 研 钵 中，充 分 研 磨 成 匀浆，加 入 灭菌 的 1 mol/L PBS 溶液 配 成 1 5乳 悬 液，反复 冻融 3次。4 8 000 r/min离心 5 min，收集上清 液，供 RNA抽 提 或 者-20 保存备 用。6.2 粪便样品 的采 集及处理 挑取 0.51.0 g粪便 样品 于 1.5 mL离心 管 内，加 入 灭菌 的 1 mol/L PBS 溶液，旋涡震荡混匀，制备 成 10%的 粪便悬 液，4 8 000 r/min离心 10 min，收集上清 液，供 RNA抽 提 或 者-20 保存备 用。6.3 阳 性 及阴 性 对照 6.3.1 阳 性 对照 用 HEV NNA-1株 等 参考株作 为 阳 性 对照 样品。6.3.2 阴 性 对照 用 0.1%DEPC 水 代替 RNA作 为 阴 性 对照。6.4 待检样品 RNA提 取 取上述处 理 好 的 样品 100 L于 1.5 mL无 RNA酶 离心 管 中，每 管 加 入 1 000 L Trizol试 剂，混匀，室 温 放 置 5 min；加 入 200 L氯仿，混匀，室 温 放 置 5 min，4，12 000 r/min离心 10 min。取上清400 L于 一个新 的 无 RNA酶 离心 管，加 入 40 LRNA助沉剂，加 入 440 L异 丙 醇，混匀，-20 放 置 30 min，4，12 000 r/min离心 10 min。弃上清，沉淀 用 0.1%DEPC 水 配置 的 75%乙醇 洗涤两 次，在 生 物 安全 柜 中 通风晾干，加 入 25 L 0.1%DEPC水 溶 解沉淀，获 得 的 RNA样品 可 直 接进行 反 转录（RT）或 置-20 以 下 保存，尽 快 使 用。本 操作 应 在一个无 RNA酶（Rnase）的 条 件下 进行。7 RT-PCR测定 7.1 RT反 应 DB22/T 2010 2014 5 在 冰浴条 件下，按下列 试 剂 用 量 在 PCR 反 应管 中 分 别 加 入各 成分：a)待检 样品 RNA：10 L；b)10 mmol/L dNTPs 混 合 物：2 L，终 浓度 为 0.8 mmol/L；c)25 mmol/L HEV外 下 游 引 物（HEV-2）：1 L，终 浓度 为 1.0 mmol/L。加 完 试 剂后 瞬时 离心 混匀。72 5min，冰浴 2min。取 出 后 再依 次加 入 下列 试 剂：d)5 RT缓冲液（RT Buffer）：5 L，终 浓度 为 1倍；e)200 U/L M-MuLV反 转录 酶：1 L，终 浓度 为 8 U/L；f)40 U/L RNA酶 抑 制剂：1 L，终 浓度 为 1.6 U/L；g)0.1%DEPC水：5 L。反 应 总 体 积 为 25 L。加 完 试 剂后 瞬时 离心 混匀。将 PCR反 应管 置 于 PCR仪内，按 如 下程 序 进行 RT反 应：42 反 应 1h；然 后 95 灭 活 反 转录 酶 5 min。RT反 应 获 得 的 cDNA 可 直 接进行 PCR反 应 或 置-20 保 存备 用。本 加样 操作 应 在一个无 RNA酶（Rnase）的 条 件下 进行。7.2 外 引 物 PCR扩增 7.2.1 扩增体系 在 冰浴条 件下，按下列 试 剂 用 量 在 PCR反 应管 中 分 别 加 入各 成 份：a)灭菌 双 蒸 水：15.7 L；b)10 PCR缓冲液（PCR Buffer）：2.5 L，终 浓度 为 1倍；c)20 mmol/L MgCl2：2.0 L，终 浓度 为 1.6 mmol/L；d)10 mmol/L dNTPs混 合 物：0.5 L，终 浓度 为 0.2 mmol/L；e)25 mmol/L HEV外引 物（HEV-1/HEV-2）：各 0.5 L，终 浓度 为 0.5 mmol/L；f)5 u/L Taq DNA聚合酶：0.3 L，终 浓度 为 0.06 u/L；g)RT反 应 产物（cDNA）：3 L。7.2.2 扩增 条件 依 次加 入 试 剂后 瞬时 离心 混匀。将 PCR反 应管 置 于 PCR仪内，按 如 下 反 应程 序 进行 PCR反 应：94 预 变性 4 min；然 后进入 94 变性 40 s，53 复性 40 s，72 延伸 60 s的 循环，共 进行 35个循环；72 彻底 延伸 10 min；4 保存。PCR产物 用于下 一 轮 内 引 物 PCR反 应。7.3 内 引 物 PCR扩增 7.3.1 扩增体系 在 冰浴条 件下，按下列 试 剂 用 量 在 PCR 反 应管 中 分 别 加 入各 成分：a)灭菌 双 蒸 水：15.7 L；b)10 PCR缓冲液（PCR Buffer）：2.5 L，终 浓度 为 1倍；c)20 mmol/L MgCl2：2.0 L，终 浓度 为 1.6 mmol/L；d)10 mmol/L dNTPs混 合 物：0.5 L，终 浓度 为 0.2 mmol/L；e)25 mmol/L HEV内 引 物（HEV-3/HEV-4）：各 0.5 L，终 浓度 为 0.5 mmol/L；f)5 u/L Taq DNA聚合酶：0.3 L，终 浓度 为 0.06 u/L；g)第 一 次 PCR 产物：3 L。7.3.2 扩增 条件 DB22/T 2010 2014 6 依 次加 入 试 剂后 瞬时 离心 混匀。将 PCR反 应管 置 于 PCR仪内，按 如 下 反 应程 序 进行 PCR反 应：94 预 变性 4 min；然 后进入 94 变性 50 s，53 复性 50 s，72 延伸 50 s的 循环，共 进行 35个循环；72 彻底 延伸 10 min；4 保存。PCR 产物 可 直 接进行 琼脂糖凝胶电泳 分析 或 置 4 保存备 用。7.4 电泳 7.4.1 1%琼脂糖凝胶 的 制备及放置 将 凝胶 托架 水 平 放 置 在 工 作 台 上，并 放 上 梳 子。称 取 1.0 g琼脂糖 于 三 角烧 瓶中，加 入 100 mL 1倍 Tris-硼酸电泳缓冲液，用 微波炉 加 热 溶 解 琼脂糖；待 琼脂糖溶液冷 却至 约 50 时，加 入 10 mg/mL溴化乙锭（EB）溶液 5 L，使 其 终 浓度 为 0.5 g/mL，充 分 混 合，避免 起 气泡，倒 入 凝胶 托架，凝胶 厚 度 控 制 在 3 5 mm之间；待 凝胶 完全 凝 固 后 轻轻拔 出 梳 子。将 凝胶 连同托架 一 起 放 入 电泳槽中，加 入 1倍 Tris-硼酸电泳缓冲液，使 之浸 过凝胶表 面约 2 mm。7.4.2 加样 将 5 L PCR 产物 与 1 L 凝胶加样缓冲液 混 合 均 匀，加 至 琼脂糖凝胶加样 孔 中。同时 在 琼脂糖凝胶 板 一 侧 加样 孔 中加 入 DNA分 子质量 标准 物。7.4.3 电泳 条件 以 5 V/cm凝胶 长 的 稳压 电泳，电泳 30 min，停止 电泳。8 结果判 定 8.1 将 电泳 后 的 琼脂糖凝胶 置 于 紫 外 光透射仪或凝胶 成 像系统 上 观察，与 DNA分 子质量 标准 物 比较，分析扩增核 苷酸 片段 大 小，然 后 拍 照 保存。当 阳 性 对照 在 328 bp位 置上 出 现 DNA扩增 带，阴 性 对照 未 出 现 目 的 扩增 带时，实验结 果 成立。8.2 若被 检 样品 在 328 bp位 置 出 现 DNA扩增 带，判 定 为 HEV阳 性，记 为 HEV(+)。8.3 若被 检 样品 在 328 bp位 置 未 出 现 DNA扩增 带，判 定 为 HEV阴 性，记 为 HEV(-)。8.4 检 测 结 果 凝胶电泳 图 见附录 B。9 废弃物处理 和 防止污染 的措施 9.1 检 测 过 程 中 分区 操作，防止交叉污染。9.2 检 测 废 弃 物高 压 灭菌 等 无 害 化 处 理。9.3 实验 前 后，实验室 用 紫 外 线消 毒。DB22/T 2010 2014 7 A A 附 录 A（规范性 附录）戊型肝炎病毒 RT-PCR检 测 试剂 的 配制 A.1 0.1%DEPC 水 的 制备 0.1%DEPC 水 按下列方法 进行配制：焦碳 酸 二 乙 酯（DEPC）：0.1 mL；双 蒸 水：100 mL；将 0.1 mL DEPC 加 入 100 mL 双 蒸 水 中 配 成 0.1%的 水 溶液，室 温作 用 12 h以 上，其 间间歇摇 匀 几 次 或 在室 温 下 磁力搅拌 20 min，然 后 1.034 105 Pa高 压 灭菌 30 min，室 温保存。DEPC是 强 的 蛋白变性 剂 和 致癌 物，开 瓶 取 用 时 应 使瓶子 尽 可 能小 心 谨慎，避免 溶液 因 内 部压力而导致飞溅。A.2 75%乙醇 的 配制 75%乙醇 按下列方法 进行配制：无水 乙醇：750 mL；0.1%DEPC 水：250 mL；在 750 mL无水 乙醇中加 入 250 mL 0.1%DEPC水，4 保存。A.3 10 mg/mL 溴化乙锭（EB）的 配制 10 mg/mL 溴化乙锭 按下列方法 进行配制：溴化乙锭（EB）：1.0 g；双 蒸 水：100 mL；在 100 mL 双 蒸 水 中加 入 1.0 g溴化乙锭（EB），用 铝箔 包 裹容 器，磁力搅拌 数 小时 以 确 保 其 完全 溶 解，然 后移 至 棕色 瓶中，保存 于 室 温。溴化乙锭（EB）是 强 诱 变 剂 并 有 中度 毒 性，使 用 含 有 这 种 染 料 的 溶液 时 应 戴 上 手套，称 量 时 应 戴 面 罩，避免 皮肤沾 染。A.4 凝胶加样缓冲液 的 配制 凝胶加样缓冲液 按下列方法 进行配制：蔗 糖：40.0 g；0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）：20 mL；10%SDS：5 mL；溴 酚蓝：50.0 mg；双 蒸 水：75 mL；先 将 蔗 糖 完全 溶 解 于双 蒸 水，然 后 按 顺 序加 入 其 余 各 成 份，待 所有成分 溶 解混 合 均 匀后，用 0.22 m的 微 孔 滤 膜 过 滤除 菌，4 保存。A.5 Tris-硼酸电泳缓冲液 的 配制 DB22/T 2010 2014 8 A.5.1 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）的 配制 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）按下列方法 进行配制：二水 乙 二 胺四 乙酸 二 钠（EDTA-Na2 2H2O）：186.1 g；氢氧 化 钠：20.0 g；双 蒸 水：定 容 至 1 000 mL；在 800 mL双 蒸 水 中加 入 186.1 g EDTA-Na2 2H2O，在 磁力搅拌 器上 剧烈 搅拌，用 氢氧 化 钠调节 溶液 pH值 至 8.0（约 需 20.0 g氢氧 化 钠颗粒），然 后 定 容 至 1 000 mL，分 装 后 1.034 105 Pa高 压 灭菌 30 min。室 温保存。A.5.2 5 倍 Tris-硼酸电泳缓冲液 的 配制 5 倍 Tris-硼酸电泳缓冲液 按下列方法 进行配制：Tris：54.0 g；硼酸：27.5 g；0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）：20 mL；双 蒸 水：定 容 至 1 000 mL。A.5.3 1 倍 Tris-硼酸电泳缓冲液 的 配制 1 倍 Tris-硼酸电泳缓冲液 按下列方法 进行配制：5倍 Tris-硼酸电泳缓冲液：100 mL；双 蒸 水：400 mL。注：本 附录 所 用 试 剂 均 为分析 纯（AR）级 别 产品。A.6 1 mol/L PBS（pH 7.2）的 配制 1 mol/L PBS（pH 7.2）按下列方法 进行配制：氯 化 钠：8.0 g；氯 化 钾：0.2 g；磷酸 氢 二 钠：1.44 g；磷酸 二 氢钾：0.24 g；双 蒸 水：定 容 至 1 000 mL；在 800 mL 双 蒸 水 中 依 次加 入上述 成分，用 1 moL/L 盐酸 调节 溶液 的 pH至 7.2，加 水 定 容 至 1 000 mL，1.034 105 Pa 高 压 灭菌 25 min。室 温保存。B DB22/T 2010 2014 9 B C 附 录 B（资料 性 附录）电泳图示 和 目 的 片段序列 B.1 凝胶电泳结果图示 凝胶电泳 检 测 结 果如图 B.1所 示。M.DNA分 子质量 标准（DNA Marker DL 2 000）；1.HEV阳 性 对照()；2.HEV阳 性 样品()；3.HEV阴 性 对照()；注：“+”表 示 检 测 结 果 阳 性，“-”表 示 检 测 结 果 阴 性。图 B.1 HEV RT-PCR 检 测 结果琼脂糖凝胶电泳图 B.2 目 的 片段基因序列 tacatgga tcacctgtga attcttacac taatacacct tacactggtg ctctcggcct gctcgatttt gcgcttgagc ttgagtttcg taatttgaca cctggtaata caaatacgcg cgtctctcgt tactcgagta gtgcgcgcca taaattgcgc cgaggggccg acggcactgc tgagttaact actactgctg ctacacggtt tatgaaggat ctccatttta cagggactaa tggcgttggt gaggttggcc gtgggatagc gcttaccttg tttaaccttg ctgacacact tctcggcggg ctcccgacag aattgattt _