福氏阿米巴原虫检测方法DB22／T 2012-2014.pdf

ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 2012 2014 福氏阿米巴原虫检测方法 Detection of Naegleria fowleri 2014-02-28发布 2014-04-30实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2012 2014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准主要起草人：曹利利、姚新华、苑淑贤、程荣华。DB22/T 2012 2014 1 福氏阿米巴原虫检测方法 警告使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了水环境中福氏阿米巴原虫的分离鉴定和聚合酶链式反应（PCR）检测方法的技术要求。本标准适用于生活用水、畜舍蓄水池中福氏阿米巴原虫的检测。2 规范性引用文件 下列文件 对 于本文件的应用 是必不可少 的。凡是注日期 的 引 用文件，仅所注日期 的 版 本适用于本文 件。凡是不注日期 的 引 用文件，其最 新 版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本文件。GB/T 6682 分 析实验室 用水规 格 和 试验 方法 3 术语和定义 下列术 语 和定 义 适用于本文件。3.1 耐格里属阿米巴原虫 Naegleria Spp.耐格里属 阿米巴 属 于 双鞭毛 阿米巴科原虫，多孳 生于 淡 水中，有滋养体 和 包囊 2个 生活 阶段，滋养 体呈长 阿米巴 型，大小为 7 20 m，在不良 环境中 可形成有 2根鞭毛 的 滋养体；包囊圆形，直径 9 m，单 核。现知该属有 5个种 N gruberi,N foweri，N lovaniensis，N jadini 和 N.austratiensis，其 中 能致病 的 以 福氏 耐格里 阿米巴原虫（N fowleri）为 主。人 或动物接触污染 水 体或在游泳 池 游泳，福氏 耐格里 阿米巴 滋养体可侵入鼻腔增殖后穿过鼻粘膜 和 筛状板，经嗅神经 上行 入 脑部寄 生，引 起 急性 原 发性 阿米巴 脑 膜 脑炎，因此又被称作“食脑 虫”。3.2 体外 培养 in vitro culture 将寄 生虫活 体 结构 或 活虫 从寄 生 体 内 或 外部 环境中分离出 来，放 在 类似 的生 存 环境（模拟 体 内温度，湿度，营 养 条 件），让 虫 体 生 长 发育 的方法并 维持 其 结构 和 功 能。3.3 聚合 酶链反 应 polymerase chain reaction PCR DB22/T 2012 2014 2 聚合酶链反应（PCR）是 一 种 级联 反 复循 环的 DNA合 成 反应 过 程。一般 由 三 个 步骤组 成：模 板 的 热变性，寡 核 苷酸 引物 复性到 单链 靶序 列 上 以 及 由 热稳 定 DNA聚合酶 催化 的 复性 引物引 导 的新生 DNA链 延伸 聚合反应的 过 程。4 试剂与材料 4.1 引 物 引物 序 列 如 下，引物 浓度 为 15 pmol/L。上 游引物：5-GTG AAA ACC TTT TTT CCA TTT ACA-3 下 游引物：5-AAA TAA AAG ATT GAC CAT TTG AAA-3 4.2 试剂 除另 有 规定，本标准 所 用 试 剂均 为 分 析 纯，水应 符 合 GB/T 6682中 4.2二级 水要求。4.2.1 阿米巴生理 盐 水(Amebic Saline,简称 AS)（见附录 A.1）4.2.2 阿米巴 无营 养 琼脂平 板(Nonnutrient Agar,简称 NNA)（见附录 A.2）4.2.3 灭 活 大 肠杆菌溶液（见附录 A.3）4.2.4 阿米巴 培 养 缓冲溶液（见附录 A.4）4.2.5 真 核 细 胞 DNA提 取 试 剂 盒 4.2.6 标准分 子量 DL2000 Marker 4.2.7 PCR反应 试 剂 盒 4.2.8 10 mg/mL溴 化 乙锭（EB）溶液（见附录 A.5）4.2.9 TAE 电 泳 缓冲液（见附录 A.6）4.2.10 1.0%琼脂 糖凝胶（见附录 A.7）4.2.11 电 泳 上 样 缓冲液（见附录 A.8）4.3 材料 4.3.1 滤器：滤孔 5 m；4.3.2 灭菌 离 心 管：1.5 mL；4.3.3 PCR反应管：0.2 mL；4.3.4 量筒:500 mL；4.3.5 锥 形 瓶:500 mL；4.3.6 吸头:10 L、200 L、1000 L；4.3.7 琼脂平 板。5 仪器设备 5.1 PCR扩 增 仪；5.2 Millipore水 过 滤系统；5.3 电 泳 槽；5.4 核 酸 电 泳 仪；5.5 紫 外 线透射仪 或 凝胶 成 像系统；5.6 可 调移 液 器（2 L、20 L、200 L、1000 L）；DB22/T 2012 2014 3 5.7 倒置显微镜；5.8 恒 温 水 浴锅：30-100；5.9 恒 温培 养 箱；5.10 分 析 天 平：感量 0.1 g；5.11 接种 环；5.12 接种 涂布器；5.13 4冰箱。6 样品 6.1 采 集 6.1.1 采 样 地 点 畜 禽饮 用水 源、畜舍蓄水池 等边缘。6.1.2 采 样位置 水 面至 水 面 下 40。6.1.3 采 样 方法 用 无菌 试 剂 瓶 直接 取指 定位 置待 检水 样 1000 mL。6.1.4 运输 保 存 常 温 密封运输保 存，20天 内 检测。6.2 前 处理 6.2.1 待 检水 样 经 单 层纱布初 步 过 滤，去 除 大 的 杂质 物。6.2.2 初 过 滤完 的水 样 经 5 m滤 膜 孔 的 Millipore水 过 滤系统进 行 负压 过 滤，留滤 膜 待 用。7 检测 7.1 分离培养 7.1.1 接种观察 水 样 过 滤完 后，将 滤 膜 翻转 后 盖 于 表面涂布 灭 活 大 肠杆菌 的 NNA培 养 基 上，接种后 置 于 28 培 养 24h，倒置显微镜 下 观察 滋养体 生 长 情况 以 判断 培 养 结 果。7.1.2 纯化培养 在 20倍 或 40倍倒置显微镜 下,检 查 NNA 平 板 上 的虫 体 集落 并标 记,然 后在 涂 有经 灭 活 大 肠杆菌 的 NNA 平 板 反 复 转 接 培 养直 至 无菌。7.1.3 鞭毛 体 观察 刮取 虫 体,放 入 盛 有 0.2 mL蒸馏 水的 1.5 mL的离 心 管中，室 温放 置 1 h，混匀 后 取 少 量 用 100倍显微镜观察 鞭毛体。DB22/T 2012 2014 4 7.2 PCR鉴 定 7.2.1 模版制备 刮取集落 虫 体，按 DNA提 取 试 剂 盒 说明书操 作。7.2.2 阳 性 及阴 性 对照 阳 性 对 照：福氏 耐格里 阿米巴标准虫 株（例 如 福氏 耐格里 阿米巴 MW4U株），DNA提 取 按 DNA提 取 试 剂 盒 说明书操 作。阴 性 对 照：用 灭菌 蒸馏 水 做相同处 理，作 为 标准 阴 性 对 照 以 及 阴 性模 板。7.2.3 PCR反 应体 系 PCR为 50 L体 系：a)灭菌 双 馏 水：26 L；b)10倍 PCR 缓冲液：5 L；c)dNTPs：4 L；d)上 游引物：2 L；e)下 游引物：2 L；f)模 板：10 L；g)Taq DNA聚合酶：1 L。在 0.5 mL反应管中按 上 述 列 表 依次加 入 上 述 试 剂，同时设立 标准 阴、阳 性 对 照 样 品 组 和 待 检 样 品 组，做好 标 记。7.2.4 扩增 94 预 变性 5 min；94 变性 30 s，52 复性 30 s，72 延伸 30 s，30个 循 环；72 延伸 7 min；4 保 存 10 min。7.2.5 扩增产物电泳 7.2.5.1 制胶 制备 1.0%琼脂 糖凝胶 板（见附录 A.7）。7.2.5.2 上样 取 8 L PCR产 物，与 2 L上 样 缓冲液 混 合，加 入 琼脂 糖凝胶 板 的 加 样孔 中。同 法 加 入 阴、阳 性 对照 PCR产 物 及 标准分 子量 DL2000 Marker。7.2.5.3 电泳 5 V/cm电压，30 min。7.2.5.4 观察 用 紫 外 凝胶 成 像仪观察 结 果。8 结果判 定 DB22/T 2012 2014 5 8.1 耐格里阿米巴 分离鉴 定 8.1.1 生长轨迹特征 在 NNA平 板 上 呈 放 射 性 生 长 并 在 倒置显微镜 下 可 见 噬 菌 空斑 的，可 初 步 判 定 为 样 品 中 存 在 阿米巴原 虫（参考 附录 B.5）。8.1.2 滋养 体 形态学特征 倒置显微镜 下 可 见 滋养体呈长圆形，外 壁光滑，可 初 步 判 定 为耐格里 阿米巴原虫（参考 附录 B.4）。8.1.3 鞭毛 体 特征 显微镜 下 可 见一 对或多根鞭毛 的虫 体，可 初 步 判 定 为耐格里 阿米巴 属 原虫（参考 附录 B.6）。8.2 PCR鉴 定 PCR产 物 电 泳后，可 见 311bp条 带，且阴、阳 性 对 照 成 立，可 判 定 为 福氏 耐格里 阿米巴原虫（参考 附 录 B.7）。9 废弃物处理 和 防止污染 的措施 9.1 检测 过 程中分 区操 作，防止交叉 污染。9.2 检测 废弃 物 高 压 灭菌 等 无 害 化 处 理。9.3 实验 前 后，实验室 用 紫 外 线 消毒。DB22/T 2012 2014 6 A A 附 录 A（规范性 附录）福氏阿米巴原虫检测 试剂 的 配置 A.1 阿米巴 生理盐水(AS)NaCl：120 mg；MgSO4.7H2O：4 mg；CaCl.2H2O：4 mg；Na2HPO4：142 mg；KH2PO4：136 mg；蒸馏 水：1000 mL。121 15min灭菌，pH=6.8，4 可 保 存 6个 月。A.2 无营养琼脂平板（NNA）阿米巴生理 盐 水：100 mL；琼脂 粉：1.5 g；121 15min灭菌，60 浇 琼脂平 板。A.3 灭活大肠杆菌溶液 制备 大 肠杆菌液 体 培 养 基（LB）1L：胰蛋白胨：10 g；酵母 提 取 物：5 g；NaCl：10 g；调至 PH=7.0，高 压 灭菌。取 5 mL LB培 养 基，接种 单 菌 落 大 肠杆菌，37 震荡 过 夜 培 养。大 肠杆菌溶液 121 高 压 10min,冷 却，4保 存 备 用。A.4 阿米巴 培养缓冲溶液配制 KH2PO4：18.1 g；Na2HPO4：25 g 蒸馏 水：1000 mL；调至 PH=6.5。A.5 溴 化 乙锭（EB）溶液 溴 化 乙锭：0.2 g；加 灭菌 蒸馏 水 至 20 mL。DB22/T 2012 2014 7 A.6 TAE电泳缓冲液制备 A.6.1 0.5 mol/L 乙 二 铵四 乙 酸二 钠 溶液 配制（pH8.0）。二 水 乙 二 铵四 乙 酸二 钠：18.6 g；灭菌 蒸馏 水：80 mL；氢氧 化 钠（1 mol/L NaOH）调 pH值 至 8.0；灭菌 蒸馏 水 加 至 100 mL。A.6.2 50倍 TAE电 泳 缓冲液 配制 三 羟甲 基 氨 基 甲烷（Tris）：242 g；冰乙 酸：57.1 mL；0.5 mol/L 乙 二 铵四 乙 酸二 钠 溶液（pH值 8.0）：100 mL；灭菌 蒸馏 水 加 至 1000 mL。作 电 泳 液 使 用 时，用 双 馏 水 50倍 稀释。A.7 1.0%琼脂 糖凝 胶板制备 琼脂 糖：1 g；50倍 TAE 电 泳 缓冲液：2 mL；灭菌 蒸馏 水：98 mL。微 波炉 中 完 全融 化，待 冷却 至 50-60 时，加 溴 化 乙锭（EB）溶液 5 L，摇匀，倒 入 电 泳板 上，凝固 后 取 下 梳 子，备 用。A.8 上样缓冲液 溴 酚蓝 0.2 g，加 10 mL灭菌 蒸馏 水 过 夜 溶 解。50 g蔗 糖 加 入 50 mL灭菌 蒸馏 水 溶 解 后，移 入 已 溶 解 的 溴 酚蓝 溶液 中，摇匀 定 容 至 100 mL。DB22/T 2012 2014 8 B B 附 录 B（资 料 性 附录）结果 图示 和 目 的 片段序列 B.1 耐格里阿米巴 形态 示意图 图 B.1 B.2 培养阳 性 结果（滋养 体 以 及 包囊 400）图 B.2 B.3 耐格里阿米巴 鞭毛 体（1000）图 B.3（注：n为 细 胞 核；f为鞭毛）B.4 福氏阿米巴原虫标准 株 PCR鉴 定 阳 性 结果 图 DB22/T 2012 2014 9 图 B.4（注：1为 DL2000;2为 福氏阿米巴原虫 阳 性 PCR扩 增 结 果）B.5 目 标 片段序列 Gtgaaaaccttttttccatttacaaaaaataactctgtgcaatggagcacacggctcgtgtatcgatgaagcccgcggcaaaaagcgatatgtaatgagattcgttagcctcgagattcatcaaattggtgaacacagtctggacctcgcaagaggtacttacgttagagtgctagttttatatcaattgatactggtaaaaggtgtatttaatcaatagatttttacgccctagctggttatgccggattctctttgagaaaaccggattgtcccatttgaaattttttcaaatggtcaatcttttattt C _ DB22/T 2012 2014 10