甘薯病毒分子检测技术规程DB4415／T 24-2023.pdf

ICS 65.020.20 CCS B 05 4415 汕尾市地方标准 DB4415/T 24 2023 甘薯病毒 分子检测 技术规程 Technical regulations for molecular detection of sweet potato virus 2023-09-14 发布 2023-10-08 实施 汕 尾 市 市 场 监 督 管 理 局 发布DB4415/T 24 2023 I 前 言 本文件 按照 GB/T 1.1 2020 标 准化工 作导 则 第 1 部分:标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规定编写。本文 件 由汕 尾市 市场 监督 管理局 提出 并归 口。本文件 起草 单位:汕 尾市 农业科 学院。本文件 主要 起草 人:柯杰、熊 振乾、周国 昌、王聪浩、方壮东、彭远 璇、范琴、叶 建东、叶祥 俊、林少钦。DB4415/T 24 2023 1 甘薯病毒分子检测 技术规程 1 范围 本文件 规定 了甘 薯病毒 分 子检测 技术 规程 的术 语和 定义、检测 对象、抽 样方 法、检 测、结果 判定 以及记录 和归 档。本文件 适用 于汕 尾 市 区域 内 甘薯 脱毒 组培 苗、原原 种、原 种以 及生 产用 种的 病毒分 子检 测。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 6682 分析 实验 室用 水规格 和试 验方 法 NY/T 402 脱毒 甘薯 种薯（苗）病 毒检 测技 术规 程 SN/T 2122 进出 境植 物及 植物产 品检 疫抽 样方 法 SN/T 2964 植物 病毒 检测 规范 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 分子检 测 molecular detection 以功能 基因、核 糖体、ITS 等区域 为标 靶，采用 分子 生物学 的方 法在 基因 水平 上对物 种进 行鉴 定。3.2 引物 primer 指一段 短的 核苷 酸序 列。其功能 是作 为核 苷酸 聚合 作用的 起点，在聚 合反 应 时，引导 合成 一条 与模板DNA 互补 的序 列。3.3 聚合酶 链式 反应 PCR;polymerase chain reaction 在DNA 聚合 酶的 作用 下，以 母链DNA 为 模板，以特 定引 物为延 伸起 点，通过 变性，退火，延伸 等步 骤，体外复 制出 与母 链DNA 互 补 的子链DNA 的过 程，是一 项 能快速 特异 性的 在体 外扩 增目的DNA 片段 的技 术。3.4 逆转录 聚合 酶链 式反 应 RT-PCR;reverse transcription polymerase chain reaction 以RNA 为模 板，通过 反转 录 形成互 补的DNA 序列，再 以 此DNA 为模 板进 行PCR 扩增，是 一项 能快 速特 异性的检 测目 的RNA 的 技术。DB4415/T 24 2023 2 4 检测对 象 4.1 DNA 病毒 a）甘 薯类 花椰 菜花 叶病 毒（SPCV）b)甘 薯曲 叶病（SPLCV）4.2 RNA 病毒 a)甘 薯褪 绿矮 化病 毒（SPCSV）b)甘 薯羽 状斑 驳病 毒（SPFMV）c)甘薯 G 病毒（SPVG）d)甘 薯潜 隐病 毒（SPLV）e)甘 薯褪 绿斑 病毒（SPCFV）f)甘 薯脉 花叶 病毒（SPVMV）g)黄 瓜花 叶病 毒（CMV）5 抽样方 法 抽样方法 应符合 SN/T 2122 和SN/T 2964 中 的 规定，遵循随 机的 原则，根 据样 品的特 性和 样品 中可能存在 的病 毒表 现出 的症 状特点，确 定取 样方 法、取样数 量、取样 工具、保 存方法 等。对实验 室检 测发 现疑 似病 毒，但还 不能 做出 准确 判 断，需要 更多 样品 进行 确 认时，需 重新 制定 更为合适的 取样 计划，进 行再 次取样。6 检测 6.1 聚 合酶 链式 反应（PCR）检测 用于检 测甘 薯DNA 病 毒。6.1.1 试剂 及缓 冲液 的配 置 试剂 及 缓冲 液用 水应符合 GB/T 6682 的规 定，配置 按NY/T 402 附 录 C.1 执 行。6.1.2 样品 DNA 的提 取 样品DNA 的 提取 按 NY/T 402 附录 C.2 执 行。6.1.3 对照 组 以ddH2O 作 为检 测的 阴性 对照。6.1.4 引物 a）甘 薯类 花椰 菜花 叶病 毒（SPCV）:F-AGGAAATCCCAGTATTATTCAAC，R-ATTTCTAATTTGGTTTACTAATCC，扩增 产物922 bp；b）甘 薯曲 叶病（SPLCV）：F-CCYTAGGGTTCGAGCTVTGTTCGG，R-TTTATTAATTDTTRTGCGAATC，扩 增产 物 823 bp。6.1.5 PCR 扩增 采用DNA 病 毒特 异引 物进 行 PCR 扩增；反 应体 系（25 L）：样 品总DNA（约100 ng/L）2 L，2Taq Master Mix 12.5 L，上、下 游引 物（10 mol/L）各 1 L，ddH2O 补 齐至25 L；扩 增条 件：DB4415/T 24 2023 3 94 2 min；94 30 s，退火 45 s，68 1 min，30 次 循环；68 10 min；4 保存；扩 增产 物用于后续 凝胶 电泳 检测。6.1.6 PCR 产物 的电 泳检 测 取10 L PCR 扩增 产物 与1 L 10 loading Buffer 混合 后，1%琼 脂糖 凝胶 恒压（120 V 150 V）下电 泳20 min 30 min，EB 染 色后，凝 胶成 像仪 拍 照观察。6.2 反 转录 聚合 酶链 式反 应（RT-PCR）检 测 用于检 测甘 薯RNA 病 毒。6.2.1 试剂 及缓 冲液 的配 置 试剂及 缓冲 液用 水应 符 合GB/T 6682 的规 定，配置 按 NY/T 402 附录 D.1 执 行。6.2.2 样品 RNA 的提 取 样品RNA 的 提取 按 NY/T 402 附录 D.2 执 行。6.2.3 对照 组 以ddH2O 作 为检 测的 阴性 对照。6.2.4 引物 a）甘 薯褪 绿矮 化病 毒（SPCSV）：F-CGGTCARATTGGAAGGT，R-TTCGCTATCAAAGAAGTRTC，扩增产 物304 bp；b）甘 薯羽 状斑 驳病 毒（SPFMV）：F-GCATGGTATGARGGAGTYAA，R-TCTTCTTCTTGCGTGGAG，扩增 产 物589 bp；c）甘 薯G 病毒（SPVG）：F-GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG，R-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA，扩增 产物1191 bp；d）甘 薯潜 隐病 毒（SPLV）：F-GCCGAYGAAACCATCMTCGAT，R-GTCTCYGGTATAAGACAAAAAG，扩增 产物1076 bp；e）甘 薯褪 绿斑 病毒（SPCFV）：F-CTATGCTGCTCACTCAAGC，R-TTGATTGGCCACAAGCGAAG，扩增 产 物 600 bp；f）甘 薯脉 花叶 病毒（SPVMV）：F-GCGAATTCTCAAGCACTGAAGAAAC，R-CTCTCGAGTTACTGCACACCTCTCATT，扩增 产 物1015 bp；g）黄 瓜花 叶病 毒（CMV）:F-ATGGACAAATCTRAATCAACCAG，R-TCARACTGGGAGCACYCCWGAYGT，扩增 产物657 bp；6.2.5 反转 录 反转录 过程 按NY/T 402 附录 D.3.2 执行。6.2.6 PCR 扩增 采用RNA 病 毒特 异引 物进 行 PCR 扩增；反应 体系（25 L）：合 成的 cDNA 2 L，2 Taq Master Mix 12.5 L，上、下 游引 物（10 mol/L）各1 L，ddH2O 补齐 至25 L；扩增 条件：94 2 min；94 30 s，退 火45 s，68 1 min，30 次循 环；68 10 min；4 保 存；扩增 产物 用于后 续 凝 胶电 泳检 测。6.2.7 PCR 产物 的电 泳检 测 取10 L PCR 扩增 产物 与1 L 10 loading Buffer 混合 后，1%琼 脂糖 凝胶 恒压（120 V 150 V）下电 泳20 min 30 min，EB 染 色后，凝 胶成 像仪 拍 照观察。DB4415/T 24 2023 4 7 结 果判 定 PCR 产 物经 电泳 检测，阳 性 对照在 预期 大小 位置 出现 特异性 条带，同 时，阴性 对照组 没有 出现 预期大小的 特异 性条 带，则判 定样品 为相 应病 毒阳 性，否则判 定样 品为 该病 毒阴 性。8 记 录和 归档 记录包 括样 品来 源、种类、检测 时间、检测 地点、检测方 法和 结果、检 测人 员签字。经 检 测 结果 判定为阳 性的 样品 应妥 善保 存于-80 冰箱 中，并作 好 登记和 标记 工作，以 备复 核用。