动物源性饲料中鸭源性成分测定 PCR方法DB22／T 2049-2014.pdf

ICS 65.120 B 46 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 2049 2014 动物源性饲料中鸭源性成分测定 PCR方法 Determination of duck derived materials in animal-originated feedstuffs PCR method 2014-02-28发布 2014-04-30实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2049 2014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、邴炜、王莹、周亮、吕航、郎乐、张庆波、宫国强。DB22/T 2049 2014 1 动物源性饲料中鸭源性成分测定 PCR方法 1 范围 本标准规定了动物源性饲料中鸭源性成分的 PCR检测方法，该方法的检出限为 0.1%。本标准适用 于 动物源性饲料中鸭源性成分的定性检测。2 规范性引用文件 下列文件对于 本 文件 的 应 用 是必不可少 的。凡是注日期 的 引 用 文件，仅所注日期 的 版 本适用 于 本 文 件。凡是不注日期 的 引 用 文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用 于 本 文件。GB/T 6682 分 析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法 GB/T 27403 实 验 室 质量 控制 规 范 食 品分 子生 物 学 检测 3 术语和定义 下列 术 语 和定 义 适用 于 本 文件。3.1 鸭源性成分 duck-derived materials 鸭 种属特异 性 DNA片段。4 原理 对样 品 进行 DNA提 取，通过 PCR扩增，检测鸭 特异 性 基因片段。5 试剂和材料 除特别说明以外，所有试剂均 为分 析纯，水 为按照 GB/T 6682规定的 一级水。所有试剂均 用 无 DNA酶污染 的 容器 分 装。5.1 鸭源性成分检测用 引 物（对）序列 为：a)上游引 物：5-CATCTATCCTGCTAGCCGCC-3 b)下游引 物：5-GGCTTGAGTGGAAGAATGCC-3 5.2 Taq DNA聚合酶。5.3 dNTP：dATP（deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosina triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。5.4 动物 基因组 DNA提 取纯化试剂 盒。5.5 RNase A酶：冻干 品，不 含 DNase。5.6 蛋白 酶 K：冻干 品。5.7 三 羟甲 基 氨 基 甲烷（Tris）。5.8 Tris饱 和 苯酚。DB22/T 2049 2014 2 5.9 三水合 乙 酸 钠、氯 化 钠。5.10 十六烷 基三 甲 基 溴 化 铵（cetyltrithylammonium bromide，CTAB）。5.11 乙二胺四乙 酸 二钠盐（EDTA-Na2 2H2O）。5.12 75%乙醇、异 丙醇、三 氯甲烷、异 戊醇、正己烷等 有 机 试剂。5.13 10 PCR缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L氯 化 钾（KCl），15 mmol/L氯化 镁（MgCl2）。5.14 分 子 量标 记：100 bp3 000 bp DNA Marker。5.15 酶 切缓冲液：含 10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），10 mmol/L MgCl2，50 mmol/L NaCl，0.1 mg/mL BSA。5.16 RNase A酶 溶液：用 高压灭菌 的 去离 子水 溶解 RNase A酶 为 10 mg/mL的 溶液，分 装 后 于-20 保存，避免反复冻融。5.17 蛋白 酶 K溶液：用 高压灭菌 的 去离 子水 溶解蛋白 酶 K为 20 mg/mL的 溶液，分 装 后 于-20 保存，避免反复冻融。5.18 乙 酸 钠溶液，3 mol/L：在 80 mL水 中，加入 40.81 g三水合 乙 酸 钠，溶解后 用 冰乙 酸 调节 pH值到 5.2，用 水 定 容 到 100 mL，分 装 后高压灭菌。5.19 Tris-HCl，1 mol/L，pH8.0：在 800 mL去离 子水 中 溶解 121.1 g Tris，冷却至 室 温后 用 浓盐 酸 调节 溶液 的 pH值至 8.0，加 水 定 容 至 1 L，分 装 后高压灭菌。5.20 EDTA，0.5 mol/L，pH8.0：称 取 186.1 g EDTA-Na2 2H2O，加入 700 mL水 中，在磁力搅拌 器上剧烈搅拌，用 10 mol/L氢 氧化 钠调 pH值至 8.0，用 水 定 容 到 1 L，分 装 后高压灭菌。5.21 CTAB提 取 缓冲液 I：在 800 mL去离 子水 中加入 46.75 g氯 化 钠，溶解后 加入 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）50 mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL，在磁力搅拌 器上 剧烈搅拌，用 10 mol/L氢 氧化 钠 调节溶液 的 pH值至 8.0，用 水 定 容 至 1 L，分 装 后高压灭菌。5.22 CTAB提 取 缓冲液 II：在 800 mL去离 子水 中加入 46.75 g氯 化 钠，20 g CTAB，完全溶解后 加入 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）50 mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL，用 水 定 容 至 1 L，分 装 后高压灭菌。5.23 Tris饱 和 苯酚 和 三 氯甲烷混 合 液，V(Tris饱 和 苯酚)+V(三 氯甲烷)=1+1。5.24 三 氯甲烷 和 异 戊醇混 合 液，V(三 氯甲烷)+V(异 戊醇)=24+1。5.25 TE缓冲液（pH8.0）：在 800 mL水 中，依次 加入 10 mL的 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）和 2 mL的 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），用 水 定 容 到 1 L，分 装 后高压灭菌。5.26 电泳缓冲液：Tris 54 g，硼 酸 27.5 g，0.5 mol/L EDTA溶液（pH8.0）20 mL，加 蒸馏 水 至 1 000 mL；使 用 时 10倍稀释。5.27 溴 化 乙锭贮存液：用 水 配 制 成 10 mg/mL。警告溴化乙锭（EB）有致癌作用，使用时要戴一次性手套。5.28 加 样 缓冲液：称 取 溴酚蓝 250 mg，加 水 10 mL，在 室 温 下过 夜溶解；再称 取 二甲腈蓝 250 mg，用 10 mL水 溶解；称 取 蔗糖 50 g，用 30 mL水 溶解，合 并 三种 溶液，用 水 定 容 至 100 mL，在 4 保存。6 仪器和设备 6.1 PCR仪。6.2 生 物 安 全 柜。6.3 离 心 机：转速 12 000 r/min。6.4 核 酸 蛋白 分 析 仪或紫 外 分 光光度计。6.5 电泳 仪。DB22/T 2049 2014 3 6.6 凝胶 成 像 分 析 系统。6.7 恒 温 水 浴锅。6.8 高压灭菌 器。6.9 pH计。6.10 移 液 器：0.5 L 10 L、10 L 100 L、20 L 200 L、200 L 1 000 L。6.11 振荡 器。7 检测步骤 7.1 试样的预处理 50 g固体 样 品 粉碎，颗粒大小 在 0.125 mm以下。7.2 DNA提取和纯化 7.2.1 CTAB法制备非油脂类饲料模板 DNA 称 取 100 mg经预处理 的 试样于 1.5 mL离 心 管 中，加入 300 L冰 上 预 冷 的 CTAB提 取 缓冲液 I，加入 500 L于 65 预热 的 CTAB提 取 缓冲液 II，混 匀，65 保温 30 min 90 min，期 间 不 时 轻 缓 颠倒 混 匀；加入 5 L25 L蛋白 酶 K溶液，上下 倒转 混 匀，37 水 浴 中 保温 1 h，中 途每隔 10 min左右倒转 混 合 数 次；待冷却至 室 温后 加入 5 L RNase A 溶液（10 mg/mL)，室 温 下 放置 30 min；室 温 12 000r/min 离 心 10 min，取上 清 液，于 另 一 干 净 的 2 mL离 心 管 中，分 别 用 等 体积 Tris饱 和 苯酚、Tris饱 和 苯酚+三 氯甲烷（1+1）和 三 氯甲烷+异 戊醇（24+1）抽 提 三 次，12 000r/min 离 心 10 min；将 上 清 液 转移 至干 净 的 2 mL离 心 管 中，加入 等 体积 异 丙醇 及 1/10体积 的 3 mol/L乙 酸 钠溶液，轻 缓 颠倒 混 匀；12 000r/min 离 心 10 min，弃 上 清液，用 500 L 75%乙醇 洗涤沉淀两 次；除 去 残留 的 乙醇，干 燥 后，DNA沉淀 溶解 于 100 L TE缓冲液（预 先 加 热 至 65 有 利 于 溶解 DNA）中，-20 保存 备 用。7.2.2 CTAB法制备油脂类饲料模板 DNA 取 油脂 饲料适量（液 态油 取 30 mL、磷 脂类 和 固态油脂 取 5 g）放 入 250 mL三 角瓶 中，加入 25 mL正己烷，于 磁力搅拌 器上不 断振荡 混 合 2 h后，加入 25 mLCTAB提 取 缓冲液 II，继续 于 磁力搅拌 器上 振荡混 合 2 h；将 溶液 转 入 100 mL离 心 管 中，于 8 000 r/min离 心 10 min，使 有 机 相 和 水 相 分 离，取下 层 水 相，加入 与 下 层 水 相 溶液等 体积 的 异 丙醇 及 水 相 溶液 1/10体积 的 3 mol/L乙 酸 钠溶液，轻 缓 颠倒 混 匀，室 温 放置 10 min；12 000r/min 离 心 10min，弃 上 清 液，待沉淀 干 燥 后 用 200 L TE缓冲液溶解 沉淀，加入 200 L Tris饱 和 苯酚+三 氯甲烷（1+1），轻 缓 颠倒 混 匀 溶液；12 000r/min 离 心 10min，取上 清 液，加入 与 上 清液等 体积 三 氯甲烷+异 戊醇（24+1），轻 缓 颠倒 混 匀，12 000r/min 离 心 2 min至 分 层；将 上 清 液 转移 至 干 净 的 离 心 管 中，加入 与 溶液等 体积 的 异 丙醇 及 溶液 1/10体积 的 3 mol/L乙 酸 钠溶液，轻 缓 颠倒 混 匀；室温 放置 10 min后，12 000r/min 离 心 10 min，弃 上 清 液后，依次 加入 800 L体积 分 数 为 75%的 乙醇 和 100 L体积 分 数 为 75%的 乙醇 洗涤沉淀；12 000r/min 离 心 5 min，除 乙醇溶液；待沉淀 干 燥 后，DNA沉淀 溶解于 100 L TE缓冲液（预先 加 热 至 65 有 利 于 溶解 DNA）中，-20 保存 备 用。7.2.3 试剂盒法 采 用 商 品 化 的动物 基因组 DNA提 取试剂 盒，按照 试剂 盒使 用 说明 提 取 DNA。注：DNA提 取 和 纯化过 程 应 用 水 作 为 核 酸 提 取 空 白 对 照。7.3 DNA浓 度 和纯 度 的测定 DB22/T 2049 2014 4 取 10 L DNA溶液 加 蒸馏 水 稀释至 1 mL，使 用 核 酸 蛋白 仪或紫 外 分 光光度计 分 别 检测 260 nm和 280 nm处 的 吸光 值。DNA的 浓 度 按照 式（1）计算，当 A260/A280比 值在 1.5 2.1之 间 时，适 宜 于 PCR扩增。扩 增 前 将 所有样 品 DNA调至 10 ng/L50 ng/L。501000ANc=.(1)式 中：c DNA浓 度，单位为 纳克 每 微升（ng/L）；A 260 nm处 的 吸光 值；N 核 酸 稀释倍 数。7.4 PCR检测 7.4.1 PCR反应体系 PCR反 应 体系 见表 1。每 个 样 品 设 置 2个平 行。表 1 PCR反应体系 试 剂 加入量（L）10 PCR 缓冲液 2.5 dNTP溶液(10 mmol/L)0.5 Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.5 上游引 物(10 mol/L)1.0 下游引 物(10 mol/L)1.0 DNA模板（10 ng/L50 ng/L)2.0 补 水 至 25 7.4.2 PCR扩增条 件 94 预 变 性 5 min，94 变 性 30 s，58 退火 30 s，72 延伸 30 s，共 35个循环，最 后 72 延伸 10 min。4 保存。不 同 仪 器、不 同 Taq DNA聚合酶可 根据 要 求 将 反 应 条 件 做 适 当 调 整。检测 过 程 中 设 置 PCR扩增 空 白 对 照、阴 性 对 照和 阳 性 对 照。用 已知 含 有 鸭源性成分的 样 品 DNA作阳 性 对 照，用 已知 不 含 有 鸭源性成分的 样 品 DNA作 阴 性 对 照，用 等 体积 的 灭菌去离 子水 代替模板 DNA作空 白 对 照。7.4.3 PCR扩增产 物 电泳 检测 取 2 g琼 脂糖，于 100 mL电泳缓冲液 中加 热，充 分 熔 化，加入 溴 化 乙锭贮存液至 终 浓 度 为 0.5 g/mL，制 胶。在电泳 槽 中加入 电泳缓冲液，使液 面刚刚没 过 凝胶。将 5 L 8 L PCR扩增 产物分 别 和适量加 样 缓冲液混 合，点 样，用分 子 量标 记 作 参 照。9 V/cm恒 压电泳，直 至溴酚蓝 指示 剂 迁 移 至 凝胶 中 部，电泳 检测 结果 用 凝胶 成 像 分 析 系统 记 录 并 保存。7.4.4 限 制性 内切酶酶切及产 物 电泳 检测 DB22/T 2049 2014 5 如果 PCR扩增 产物 电泳 检测 结果阳 性，进行 限 制 性 内 切 酶酶 切反 应 或 进行 测 序（序列 参考附录 A）。酶 切反 应 体系（20 L）：Stu I 酶 2 U，酶 切缓冲液 2 L，加入 PCR扩增 产物 至 总 体积 20 L。酶 切在 37 下进行，20 min。酶 切完 成 后电泳，方法 见 7.4.3。8 结果判断与表述 8.1 PCR扩增产 物 电泳 检测 结果 阳 性 样 品的 PCR扩增 产物 大小 为 201 bp（序列 参考附录 A）。8.2 限 制性 内切酶酶切结果 阳 性 样 品 PCR产物 采 用 内 切 酶 Stu I 酶 切后，酶 切 片段 大小 为 118 bp和 83 bp。8.3 结果表述 PCR产物为 阳 性，限 制 性 内 切 酶酶 切 产物 片段 大小 正 确，确认 含 有 鸭源性成分，表述 为检出鸭源性 成分；酶 切 产物 片段 大小 不 正 确，确认 不 含 有 鸭源性成分，表述 为 未 检出鸭源性成分。PCR产物为 阴 性 者判 定 不 含 有 鸭源性成分，表述 为 未 检出鸭源性成分。9 检测 过程 中 防止交叉污染 的 措 施 按照 GB/T 27403执 行。DB22/T 2049 2014 6 附 录 A（资 料性 附录）PCR产 物测 序结果 CATCTATCCT GCTAGCCGCC GGCCTCTTAT CAATGCTCCT AGTGATACTC CAATGATGAC GGGACATTGT CCGAGAGAGC ACCTTCCAAG GCCACCACAC ACCTACAGTC CAAAAAGGCC TACGATACGG CATAATCCTC TTCATCACAT CCGAAGCTTT CTTCTTCCTA GGATTTTTCT GGGCATTCTT CCACTCAAGC C A