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I C S 1 1.2 2 0B 4 1备 案 号：DB42湖 北 省 地 方 标 准D B 4 2/T 7 8 8 2 0 1 2猪 流 感 病 毒(H 1 亚 型)酶 联 免 疫 吸 附 试 验 抗体 检 测 方 法M e t h o d o f t h e E n z y m e-l i n k e d i m m u n o s o b e n t a s s a y f o r t h e d e t e c t i o n o f a n t i b o d i e sa g a i n s t s w i n e i n f l u e n z a v i r u s(s u b t y p e H 1)2 0 1 2-0 1-0 6 发 布 2 0 1 2-0 3-0 1 实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局发 布D B 4 2/T 7 8 8 2 0 1 2I目 次前 言.I I引 言.I I I1 范 围.12 缩 略 词.13 实 验 原 理.14 实 验 条 件.15 实 验 材 料.16 实 验 方 法.27 结 果 判 定.38 注 意 事 项.3附 录 A.4D B 4 2/T 7 8 8 2 0 1 2I I前 言本 标 准 按 G B/T 1.1-2 0 0 9 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口。本 标 准 起 草 单 位：华 中 农 业 大 学 动 物 医 学 院、武 汉 科 前 动 物 生 物 制 品 有 限 责 任 公 司、湖 北 省 动 物 疫病 预 防 控 制 中 心。本 标 准 主 要 起 草 人：金 梅 林、郭 学 波、杨 影、陈 焕 春、徐 高 原、钟 广 汉、宋 念 华、田 峰、董 晓 辉、孙 小 美、李 淑 云。D B 4 2/T 7 8 8 2 0 1 2I I I引 言猪 流 感 病 毒(S w i n e I n f l u e n z a V i r u s,S I V)属 正 粘 病 毒 科，可 引 起 猪 流 行 性 感 冒(S w i n e I n f l u e n z a,S I)。在 猪 群 中 广 泛 流 行 的 S I V 主 要 是 古 典 型 H 1 N 1 和 类 禽 型 H 1 N 1，可 引 起 猪 咳 嗽、呼 吸 困 难、发 热 和 衰 竭等 症 状 易 暴 发 流 行。由 于 S I V 对 呼 吸 道 上 皮 的 高 度 特 异 亲 嗜 性 而 使 呼 吸 道 管 壁 上 皮 受 损，导 致 猪 链 球菌、胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌、副 猪 嗜 血 杆 菌、巴 氏 杆 菌 等 细 菌 和 猪 呼 吸 道 冠 状 病 毒、猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病毒 等 的 继 发 或 混 合 感 染，使 病 情 更 为 复 杂。为 开 展 猪 流 感 的 免 疫 监 测，了 解 猪 群 猪 流 感 病 毒 抗 体 水 平，指 导 猪 流 感 免 疫 预 防 工 作，特 制 定 本 标 准。D B 4 2/T 7 8 8 2 0 1 21猪 流 感 病 毒(H 1 亚 型)酶 联 免 疫 吸 附 试 验 抗 体 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 猪 流 感 病 毒(H 1 亚 型)酶 联 免 疫 吸 附 试 验 抗 体 检 测 方 法 的 缩 略 词、实 验 原 理、实 验 条件、实 验 材 料、实 验 方 法、结 果 判 定 和 注 意 事 项 等。本 标 准 适 用 于 猪 血 清 中 的 流 感 病 毒 抗 体 的 检 测。2 缩 略 词下 列 缩 略 词 适 用 于 本 文 件。E L I S A（e n z y m e-l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y）：酶 联 免 疫 吸 附 试 验O D 6 3 0 n m 值：6 3 0 纳 米 波 长 处 的 吸 光 值H R P：辣 根 过 氧 化 物 酶H I 法：血 凝 抑 制 试 验 法S：样 品 孔 O D 6 3 0 n m 值P：阳 性 对 照 孔 O D 6 3 0 n m 平 均 值3 实 验 原 理应 用 酶 联 免 疫 原 理 制 成 检 测 猪 流 感 病 毒（H 1 亚 型）抗 体 的 间 接 E L I S A 方 法。利 用 抗 原 抗 体 反 应 的特 异 性，将 特 异 性 的 猪 流 感 病 毒（H 1 亚 型）抗 原 吸 附 到 固 相 载 体 的 表 面 后，待 检 物 中 若 含 有 相 应 的 抗体，则 可 与 所 包 被 的 抗 原 相 结 合，并 能 进 一 步 和 酶 标 记 抗 体 结 合 形 成 复 合 物。在 遇 到 相 应 的 底 物 时，复合 物 中 的 酶 能 催 化 底 物 发 生 显 色 反 应。其 显 色 的 深 浅 与 相 应 的 抗 体 量 成 正 相 关，可 借 助 O D 6 3 0 n m 值 的 大小 进 行 定 性 判 断。4 实 验 条 件4.1 实 验 室实 验 操 作 宜 在 常 温（1 8 2 5）进 行。4.2 仪 器台 式 低 温 高 速 离 心 机、微 量 移 液 器、冰 箱、恒 温 箱、酶 标 仪。4.3 人 员注 意 个 人 防 护 和 环 境 保 护。5 实 验 材 料D B 4 2/T 7 8 8 2 0 1 225.1 猪 流 感 病 毒（H 1 亚 型）抗 原（见 附 录 A.8）。5.2 酶 标 板：9 6 孔 板，可 拆。5.3 酶 标 记 抗 体（见 附 录 A.9）。5.4 阳 性 对 照 血 清（见 附 录 A.1 0）。5.5 阴 性 对 照 血 清（见 附 录 A.1 1）。5.6 其 它 试 剂包 被 液、封 闭 液、洗 涤 液、样 品 稀 释 液、底 物 液 A、底 物 液 B、终 止 液。试 剂 配 方 及 要 求 见 附 录A。6 实 验 方 法6.1 样 品 采 集将 采 集 的 猪 全 血 静 置 3 0 m i n，收 集 上 清 备 用。6.2 抗 原 包 被 板 制 备取 猪 流 感 病 毒（H 1 亚 型）抗 原 用 包 被 液 稀 释 到 工 作 浓 度（2.5 g/m L），加 入 酶 标 板，1 0 0 L/孔，3 7 孵 育 2 h。弃 去 孔 中 液 体，拍 干。加 入 封 闭 液，2 0 0 L/孔，于 3 7 封 闭 2 h，取 出 酶 标 板 弃 去 孔 中液 体 在 吸 水 纸 上 拍 干，于 2 8 保 存，可 保 存 7 d。6.3 样 品 稀 释在 血 清 稀 释 板 中 按 1:4 0 的 比 例 稀 释 样 品（例 如：1 9 5 L 样 品 稀 释 液 中 加 入 5 L 样 品，即 为 1:4 0稀 释）。稀 释 好 的 样 品 可 在 2 8 保 存 7 d。6.4 加 样取 出 抗 原 包 被 板（根 据 样 品 多 少，可 拆 开 分 次 使 用），先 用 洗 涤 液 洗 板 1 次，再 将 稀 释 好 的 样 品 取加 入 抗 原 包 被 板，1 0 0 L/孔。同 时 设 2 孔 阴 性 对 照、2 孔 阳 性 对 照 及 1 孔 空 白 对 照，轻 轻 振 匀 孔 中 样 品（勿 溢 出），置 3 7 下 孵 育 3 0 m i n。6.5 洗 涤取 出 抗 原 包 被 板 弃 去 孔 中 液 体，在 吸 水 纸 上 拍 干，用 洗 涤 液 洗 板 3 次，2 0 0 L/孔。每 次 静 置 3 m i n后 倒 掉 液 体，在 吸 水 纸 上 拍 干。6.6 加 酶 标 记 抗 体取 酶 标 记 抗 体 用 样 品 稀 释 液 稀 释 到 工 作 浓 度，加 入 酶 标 板，1 0 0 L/孔，3 7 孵 育 3 0 m i n。按 6.5中 方 法 洗 板 3 次。6.7 加 底 物 液每 孔 加 底 物 液 A 和 底 物 液 B 各 5 0 L，混 匀，置 室 温 下（1 8 2 5）避 光 显 色 1 0 m i n。6.8 加 终 止 液每 孔 加 终 止 液 5 0 L，轻 轻 振 荡 混 匀。6.9 测 定 结 果D B 4 2/T 7 8 8 2 0 1 23以 空 白 对 照 孔 调 零，用 酶 标 仪 测 定 各 孔 的 O D 6 3 0 n m 值。测 定 结 果 必 须 在 加 入 终 止 液 后 1 0 m i n 内 完 成。7 结 果 判 定7.1 试 验 成 立 的 条 件 是 两 个 阳 性 对 照 孔 的 O D 6 3 0 n m 值 相 差 应 0.3；两 个 阳 性 对 照 孔 O D 6 3 0 n m 值 均 应 0.8，且 1.6。两 个 阴 性 对 照 孔 O D 6 3 0 n m 值 均 应 0.2。7.2 如 果 S 0.3，判 为 阳 性；如 果 S 0.3，则 判 为 阴 性。8 注 意 事 项实 验 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 生 物 安 全 防 护 措 施，废 弃 物 应 做 无 害 化 处 理。D B 4 2/T 7 8 8 2 0 1 24A A附 录 A（规 范 性 附 录）试 剂 的 配 制A.1 包 被 液 的 配 制碳 酸 钠（N a 2 C O 3）1.5 9 g碳 酸 氢 钠（N a H C O 3）2.9 3 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1 0 0 0 m L 即 可，置 2 8 下 保 存。A.2 封 闭 液 的 配 制5 g 牛 血 清 白 蛋 白（B S A）溶 于 1 0 0 0 m L 洗 涤 液。置 2 8 下 保 存。A.3 洗 涤 液 的 配 制氯 化 钠（N a C l）8 g氯 化 钾（K C l）0.2 g磷 酸 氢 二 钠（N a 2 H P O 4 1 2 H 2 O）2.9 g磷 酸 二 氢 钾（K H 2 P O 4）0.2 gT w e e n-2 0 0.5 m L加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1 0 0 0 m L 即 可。置 2 8 下 保 存。A.4 样 品 稀 释 液 的 配 制牛 血 清 白 蛋 白（B S A）5.0 g二 甲 基 亚 砜（D M S O）1 0 m L加 洗 涤 定 容 至 1 0 0 0 m L。置 2 8 下 保 存。A.5 底 物 液 A 的 配 制磷 酸 氢 二 钠（N a 2 H P O 4）1 4.6 g柠 檬 酸（C 6 H 8 O 7）9.3 3 g过 氧 化 脲（C H 6 N 2 O 3）0.5 2 g加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L用 盐 酸 调 p H 值 至 5.0 5.4，置 2 8 下 保 存。A.6 底 物 液 B 的 配 制四 甲 基 联 苯 胺（T M B）2 0 m g无 水 乙 醇（C 2 H 6 O）1 0 m LD B 4 2/T 7 8 8 2 0 1 25加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L置 2 8 下 避 光 保 存。A.7 终 止 液 的 配 制4 0%的 氢 氟 酸(H F)6 2 5 L加 蒸 馏 水 至 1 0 0 m L置 2 8 下 保 存。A.8 猪 流 感 病 毒（H 1 亚 型）抗 原猪 流 感 病 毒（H 1 亚 型）抗 原 由 基 因 工 程 技 术 表 达 获 得。-2 0 下 保 存 备 用。A.9 酶 标 记 抗 体酶 标 记 抗 体 由 羊 抗 猪 I g G 经 H R P 标 记 获 得。2 8 下 保 存 备 用。A.1 0 阳 性 对 照 血 清通 过 筛 选 猪 流 感 病 毒（H 1 亚 型）抗 体 阳 性 猪 获 得，效 价 应 大 于 7 l o g 2（H I 法）。2 8 下 保存 备 用。A.1 1 阴 性 对 照 血 清通 过 筛 选 猪 流 感 病 毒（H 1 亚 型）抗 体 阴 性 猪 获 得，效 价 应 小 于 2 l o g 2（H I 法）。2 8 下 保存 备 用。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
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