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I C S 1 1.2 2 0B 4 1备 案 号:3 8 1 0 5-2 0 1 3DB42湖 北 省 地 方 标 准D B 4 2/T 8 9 4 2 0 1 3猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 A p x-E L I S A 抗 体检 测 方 法E n z y m e-l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y t o d e t e c t t h e a n t i b o d y a g a i n s t A p x o fA c t i n o b a c i l l u s p l e u r o p n e u m o n i a e2 0 1 3-0 3-1 4 发 布 2 0 1 3-0 6-0 1 实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局发 布D B 4 2/T 8 9 4 2 0 1 3I目 次前 言.I I引 言.I I I1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 缩 略 语.14 检 测 原 理.15 检 测 条 件.26 检 测 材 料.27 检 测 方 法.28 结 果 判 定.39 注 意 事 项.3附 录 A.4附 录 B.6D B 4 2/T 8 9 4 2 0 1 3I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 0 9 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口。本 标 准 起 草 单 位：华 中 农 业 大 学、武 汉 科 前 动 物 生 物 制 品 有 限 责 任 公 司、湖 北 省 动 物 疫 病 预 防 控 制中 心。本 标 准 主 要 起 草 人：周 锐、金 梅 林、陈 焕 春、宋 念 华、董 晓 辉、金 卉。D B 4 2/T 8 9 4 2 0 1 3I I I引 言猪 传 染 性 胸 膜 肺 炎（p o r c i n e c o n t a g i o u s p l e u r o p n e u m o n i a）是 由 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌（A c t i n o b a c i l l u sp l e u r o p n e u m o n i a e,A P P）引 起 的 一 种 猪 的 重 要 呼 吸 道 传 染 病，以 纤 维 性、出 血 性、坏 死 性 胸 膜 炎 和 肺 炎为 主 要 特 征，多 呈 急 性 经 过，导 致 感 染 猪 急 性 死 亡。急 性 感 染 耐 过 猪 或 隐 性 感 染 猪 会 影 响 日 增 重，延 迟出 栏 时 间。本 病 呈 世 界 性 分 布，是 危 害 养 猪 业 最 严 重 的 呼 吸 道 细 菌 性 传 染 病 之 一。A p x I V A 是 A P P 特 异 性 的 体 内 诱 导 抗 原。本 标 准 以 A p x I V A 重 组 蛋 白 为 抗 原 建 立 的 间 接 E L I S A 抗体 检 测 方 法，不 仅 适 用 于 A P P 感 染 的 特 异 性 诊 断，而 且 可 以 用 于 区 分 A P P 灭 活 疫 苗 或 A p x I V 基 因 缺 失疫 苗 免 疫 猪 与 自 然 感 染 猪 的 鉴 别 诊 断。本 标 准 参 照 国 家 二 类 新 兽 药“猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 A p x I V-E L I S A 抗 体 检 测 试 剂 盒”（2 0 1 0 新 兽 药证 字 4 9 号）的 质 量 标 准 及 其 使 用 说 明 书 制 定，为 国 内 首 次 提 出。D B 4 2/T 8 9 4 2 0 1 31猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 A p x-E L I S A 抗 体 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 A p x 抗 体 的 酶 联 免 疫 吸 附 试 验（E L I S A）检 测 方 法 的 缩 略 语、检 测 原 理、检 测 条 件、检 测 材 料、检 测 方 法、结 果 判 定 和 注 意 事 项 等。本 标 准 适 用 于 猪 血 清 中 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 A p x 的 抗 体 的 检 测。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的。凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。兽 用 生 物 制 品 质 量 标 准 汇 编（2 0 1 0）猪 传 染 性 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 A p x-E L I S A 抗 体 检 测 试 剂 盒 质 量标 准。G B/T 6 6 8 2-2 0 0 8 中 国 实 验 室 用 水 国 家 标 准。3 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 标 准。猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 A c t i n o b a c i l l u s p l e u r o p n e u m o n i a e A P P胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 A p x I V 毒 素 的 A 蛋 白 A p x I V A酶 联 免 疫 吸 附 试 验 E n z y m e-l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y E L I S A6 3 0 纳 米 波 长 处 的 吸 光 值 O D 6 3 0 n m 值阳 性 对 照 孔 O D 6 3 0 n m 值 的 平 均 值 P样 品 孔 O D 6 3 0 n m 值 S4 检 测 原 理A p x I V A 毒 素 是 A P P 种 特 异 性 的 外 毒 素，但 在 体 外 培 养 A P P 时 并 不 能 够 检 测 到 A p x I V A 毒 素，只有 在 感 染 猪 体 内 才 能 够 检 测 到 A p x I V A 毒 素 及 其 抗 体，因 此，通 过 检 测 猪 血 清 中 A p x I V A 毒 素 的 抗 体，可 以 诊 断 猪 是 否 感 染 了 A P P。A P P 的 A p x I V A 抗 体 E L I S A 检 测 技 术 是 利 用 被 检 样 品 中 的 抗 体 与 包 被 在 酶 标 板 上 的 A p x I V A 抗 原发 生 反 应，然 后 通 过 洗 涤 把 未 结 合 的 抗 体 及 其 他 物 质 去 除。再 加 入 羊 抗 猪 I g G 酶 标 抗 体，酶 标 抗 体 与抗 原 抗 体 复 合 物 结 合，加 入 底 物 后，底 物 被 酶 催 化 成 有 色 产 物，产 物 的 颜 色 深 浅 与 样 品 中 抗 体 的 量 呈 正相 关，故 可 根 据 O D 6 3 0 n m 值 判 定 被 检 样 品 中 A p x I V A 的 抗 体 水 平。5 检 测 条 件D B 4 2/T 8 9 4 2 0 1 325.1 环 境 温 度检 测 过 程 宜 在 室 温（1 8 2 5）进 行。5.2 主 要 仪 器台 式 低 温 离 心 机、微 量 移 液 器、2 8 冰 箱、恒 温 箱、酶 标 检 测 仪。6 检 测 材 料猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 重 组 A p x I V A 蛋 白、阳 性 对 照 血 清、阴 性 对 照 血 清、羊 抗 猪 I g G 酶 标 抗 体、9 6孔 酶 标 板、包 被 液、封 闭 液、样 品 稀 释 液、洗 涤 液、底 物 液 A、底 物 液 B、终 止 液。试 剂 的 配 制 见 附 录A。7 检 测 方 法7.1 样 品 处 理取 待 检 测 猪 的 血 液，待 血 液 凝 固 后，以 4 0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n，收 集 血 清。也 可 采 集 血 液，待 凝 固后 自 然 析 出 血 清。血 清 呈 淡 黄 色，无 严 重 溶 血。具 体 血 液 采 集 与 样 品 处 理 注 意 事 项 见 附 录 B。7.2 包 被用 包 被 液 将 抗 原（猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 重 组 A p x I V A 蛋 白）稀 释 到 工 作 浓 度（6.2 5 g/m L）加 入 酶标 板 孔 内，每 孔 1 0 0 L，3 7 孵 育 1 h 后，再 置 2 8，8 h 1 0 h。7.3 封 闭取 出 抗 原 包 被 板，弃 去 孔 中 包 被 液，在 干 净 的 吸 水 纸 上 拍 干。每 孔 加 入 洗 涤 液 1 2 0 L，静 置 3 m i n，弃 去 洗 涤 液 后 拍 干，重 复 洗 涤 3 次。然 后 加 封 闭 液，2 0 0 L/孔，于 3 7 封 闭 2 h，甩 干 封 闭 液，自 然干 燥。于 2 8 保 存（密 封 可 保 存 6 个 月）。7.4 样 品 稀 释将 待 检 血 清 用 样 品 稀 释 液 按 1:4 0 的 比 例 稀 释（1 9 5 L 样 品 稀 释 液 中 加 5 L 待 检 血 清），对 照 血 清用 血 清 稀 释 液 按 1:4 的 比 例 稀 释（1 8 0 L 样 品 稀 释 液 中 加 6 0 L 对 照 血 清）。7.5 加 样将 稀 释 好 的 待 检 血 清 和 对 照 血 清 各 取 1 0 0 L 加 入 到 抗 原 包 被 板 的 孔 中，待 检 血 清 作 1 孔，阴 性 对照 和 阳 性 对 照 各 作 2 孔，轻 轻 振 匀 孔 中 样 品（勿 溢 出），置 3 7 下 孵 育 3 0 m i n。7.6 洗 涤弃 去 9 6 孔 酶 标 板 孔 中 的 溶 液，加 入 洗 涤 液 2 0 0 L/孔，静 置 3 m i n 后 弃 去 洗 涤 液，并 在 干 净 的 吸 水纸 上 拍 干，重 复 洗 涤 5 次。7.7 加 酶 标 抗 体D B 4 2/T 8 9 4 2 0 1 33每 孔 加 酶 标 抗 体 1 0 0 L，置 3 7 下 孵 育 3 0 m i n，按 7.6 中 的 方 法 洗 涤 5 次。7.8 加 底 物每 孔 先 加 底 物 液 A 5 0 L，再 加 底 物 液 B 5 0 L，轻 轻 振 荡 混 匀，室 温（1 8 2 5）避 光 显 色 1 0m i n。7.9 终 止 反 应每 孔 加 终 止 液 5 0 L，轻 轻 振 荡 混 匀，1 0 m i n 内 测 定 结 果。7.1 0 测 定 吸 光 值在 酶 标 检 测 仪 上 于 6 3 0 n m 波 长 处 测 定 各 孔 的 O D 6 3 0 n m 值。8 结 果 判 定结 果 成 立 的 条 件：阳 性 对 照 孔 O D 6 3 0 n m 值 均 0.8，且 1.6；阴 性 对 照 孔 O D 6 3 0 n m 值 均 0.2。如 果 S P 0.2 5，判 为 阳 性；如 果 S P 0.2 5，判 为 阴 性。9 注 意 事 项检 测 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 生 物 安 全 防 护 措 施，废 弃 物 做 无 害 化 处 理（详 见 附 录 B）。D B 4 2/T 8 9 4 2 0 1 34A A附 录 A（规 范 性 附 录）试 剂 的 配 制A.1 酶 标 抗 体将 羊 抗 猪 I g G 酶 标 抗 体（S o u t h e r n B i o t e c h n o l o g y A s s o c i a t e s（S B A）公 司）用 样 品 稀 释 液 按 1:5 0 0 0稀 释，置 4 保 存 可 使 用 7 天。A.2 包 被 液碳 酸 钠（N a 2 C O 3）1.5 9 g碳 酸 氢 钠(N a H C O 3)2.9 3 g加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L置 2 8 下 保 存 备 用。A.3 封 闭 液牛 血 清 白 蛋 白（B S A）0.5 g蔗 糖（C 1 2 H 2 2 O 1 1）1.0 g加 洗 涤 液 至 1 0 0 m L置 2 8 下 保 存 备 用。A.4 样 品 稀 释 液牛 血 清 白 蛋 白（B S A）0.5 g加 洗 涤 液 至 1 0 0 m L置 2 8 下 保 存 备 用。A.5 洗 涤 液氯 化 钠（N a C l）8.0 g氯 化 钾（K C l）0.2 g磷 酸 氢 二 钠(N a 2 H P O 4 1 2 H 2 O)2.9 g磷 酸 二 氢 钠（N a H 2 P O 4）0.2 g吐 温-2 0（T w e e n-2 0）0.5 m L加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L置 2 8 下 保 存 备 用。A.6 底 物 液 A磷 酸 氢 二 钠（N a 2 H P O 4）1 4.6 0 g柠 檬 酸（C 6 H 8 O 7）9.3 3 gD B 4 2/T 8 9 4 2 0 1 35过 氧 化 脲（C H 6 N 2 O 3）0.5 2 g加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L用 H C l 调 p H 值 至 5.0 5.4，置 2 8 下 保 存 备 用。A.7 底 物 液 B四 甲 基 联 苯 胺（T M B）2 0 m g无 水 乙 醇（C 2 H 6 O）1 0 m L加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L置 2 8 下 避 光 保 存 备 用。A.8 终 止 液4 0%的 氢 氟 酸(H F)6 2 5 L加 蒸 馏 水 至 1 0 0 m L置 2 8 下 保 存 备 用。D B 4 2/T 8 9 4 2 0 1 36B B附 录 B（规 范 性 附 录）注 意 事 项B.1 血 样 采 集 及 处 理 过 程，应 进 行 无 菌 操 作，防 止 样 本 因 污 染 发 生 变 质。存 放 血 样 的 容 器 应 无 菌，可 使用 一 次 性 灭 菌 容 器。B.2 血 液 自 然 凝 固 后 无 菌 分 离 血 清 装 入 灭 菌 离 心 管 或 小 瓶 中，加 盖 密 封 后 置 2 8 下 冷 藏 保 存。每份 血 清 样 品 贴 标 签 并 写 明 编 号、采 集 地 点、免 疫 背 景、时 间 等，以 便 通 过 抗 体 检 测，做 出 追 溯 性 诊断。B.3 采 样 及 检 测 过 程，应 穿 工 作 服，戴 口 罩 和 一 次 性 手 套。B.4 血 样 处 理 及 检 测 过 程 中 产 生 的 废 弃 物 应 放 入 专 门 的 废 弃 物 容 器，废 弃 物 经 高 压 消 毒 后 按 有 关 规 定 处理。B.5 应 符 合 病 原 微 生 物 实 验 室 生 物 安 全 管 理 条 例 的 其 它 生 物 安 全 技 术 要 求。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _D B 4 2/T 8 9 4 2 0 1 3
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