鲟鱼种质鉴定规范DB11／T 987-2013.pdf

ICS 65.150 B 50 备案号:38199-2013 DB11 北京市地方标准 DB11/T 987 2013 鲟鱼种质鉴定规范 Rules of sturgeon germplasm identification 2013-06-21发布 2013-10-01实施 北京市质量技术监督局 发布 DB11/T 987 2013 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 学名与分类.1 4 生物学特征.1 5 生长与繁殖.2 6 遗传学特征.3 7 检测方法.5 8 检测规则.7 参考文献.8 DB11/T 987 2013 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。本标准由北京市农业局提出。本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。本标准由北京市农业局组织实施。本标准起草单位：北京市水产科学研究所。本标准主要起草人：胡红霞、朱华、董颖、田照辉、王巍。DB11/T 987 2013 1 鲟鱼种质鉴定规范 1 范围 本标准适用于西伯利亚鲟（Acipenser baerii）种质 的检测 和鉴定。本标准给出 了 西伯利亚鲟的学名与分类、主要生物学特征、生长与繁殖、遗传学特征 及 检测方法。2 规范性引用文件 下列 文件 对 于本文件的 应 用 是必不可少 的。凡是注日期 的引用文件，仅 所 注日期 的 版 本适用于本文件。凡是不注日期 的引用文件，其最新版 本（包括 所 有 的 修改 单）适用于本文件。GB 17716 青鱼 GB/T 18654.2 养 殖 鱼 类 种质 检 验 第 2部 分 抽样 方法 3 学名与分类 3.1 学名 西伯利亚鲟（Acipenser baerii）3.2 分类地位 属 鲟 形目（Acipenseriformes）,鲟科（Acipenseridae）,鲟 属(Acipenser)。4 生物学特征 4.1 外部形态 鱼体修 长，呈纺锤形，横切呈五角形，向尾部延伸变细，吻 长 尖，口 腹 位，口 裂较小，一字形。歪形尾，鳃盖骨愈合为一,鳃盖膜彼此不相连而 与 颊部相连。体裸露无鳞具五列骨板，1列背骨板，2两列侧骨板，2列腹骨板；第一背骨板不是最大 的 骨板,身体最高点不在第一骨板处；侧骨板通 常 与 躯干 部 颜色 相 似；腹骨板 与 背骨板 间 具有 许多星状薄 骨板 或微 小 颗粒，吻 须 4根，介 于 吻 突 与口 裂 之间，稍靠近口 裂。鳃 耙 有 结节，一 般 为 3个。鱼体背部呈 淡灰黑色或暗褐色，两侧较 淡，腹部为 白色。西伯利亚鲟的 外 部形 态见图 1。DB11/T 987 2013 2 图 1 西伯利亚鲟外部形态图（引自 FAO）4.2 可数性状 背 鳍鳍式：D.30 56。臀鳍鳍式：A.17 33。背骨板 数：10 20。侧骨板 数：37 56，通 常 为 42 47。腹骨板 数：7 16。第一鳃 弓（左）外 侧鳃 耙数：20 49，通 常 为 27 32。4.3 可量性状比例 西伯利亚鲟 鱼种、成 鱼和 亲 鱼 的 可 量 性 状比例见表 1。表 1 西伯利亚鲟的可量性状比例（平均值标准差）项 目 年龄 鱼种（8月龄）成 鱼（3龄）亲 鱼（10龄）全 长/体 长a 1.31 0.04 1.25 0.06 1.28 0.04 体 长/体高 6.65 0.64 6.15 0.04 5.53 0.51 体 长/头 长 3.69 0.25 3.79 0.34 4.09 0.28 头 长/吻 长 1.74 0.17 2.09 0.18 2.09 0.17 头 长/眼径 22.13 1.97 23.52 6.72 23.70 4.21 头 长/眼间距 3.59 0.48 3.17 0.39 3.29 0.30 头 长/尾 柄 高 8.47 1.23 6.39 1.51 5.75 1.01 尾 柄 长/尾 柄 高 2.84 0.64 2.28 0.57 2.5 0.52 a采 用 从 吻 端到 尾 鳍基 部 的长 度 5 生长与繁殖 5.1 生长 DB11/T 987 2013 3 在 人 工 养 殖 条 件 下,不 同年龄 组的西伯利亚鲟 鱼体 长 和体 重 范围 见表 2。表 2 西伯利亚鲟各年龄组体长和体重范围 年龄 a 1 2 3 4 5 体 长 cm 40 50 50 70 70 85 90 100 100 120 体 重 g 400 600 1500 2000 3000 4000 5000 7000 7000 9000 a依据 北方 地区流 水 养 殖 模式，年龄以周年计 5.2 繁殖 性 成熟年龄：自然条 件 下 雌 鱼为 19龄 20龄，雄 鱼为 17龄 18龄；人 工 养 殖 条 件 下 雌 鱼为 7龄以上，雄 鱼为 5龄以上。繁殖 周 期：野 生 状态 下为 2年以上；人 工 养 殖 条 件 下为 1年以上。怀卵量占 体 重 的 10%30%。6 遗传学特征 6.1 细胞遗传学特征 采 用 流式 细 胞仪 测 定 西伯利亚鲟 鱼细 胞中 DNA含量 为 N=8.98 0.115 pg。6.2 生化遗传学特征 西伯利亚鲟 肝脏酯酶（EST）同工 酶 有 6条 酶带，电泳 图 及 酶带电泳 模式图见图 2。1为 电泳 图 谱，2为 模式图 图 2 西伯利亚鲟肝脏酯酶电泳图谱及 模式 图 6.3 分 子 遗传学标 记 6.3.1 西伯利亚鲟特 异 性 RAPD遗传图谱的 建立 及特征标 记 RAPD引物（CCGCCCAAAC）PCR扩增 的 结 果如 图 3所 示。DB11/T 987 2013 4 图 3 RAPD引物的 扩增产 物 1为 西伯利亚鲟 池，2、3 为 西伯利亚鲟 个 体，4为 marker 6.3.2 西伯利亚鲟 微卫星 DNA分 子 标 记 的 建立 采 用 14对 微 卫 星 引物 进行 基 因型 鉴定，西伯利亚鲟 在 这 14对 引物的 等 位 基 因 长 度 范围 见表 3。基 因 型 数据 分 析 结 果 见图 4。表 3 14个微卫星 引物 序列 及 其在 西伯利亚鲟的 等 位 基因 长 度 范围 位 点 名 称 引物 序 列(5-3)等 位 基 因 长 度 范围(bp)Atr-1101 F:TATCCCCTCCACTGGAAAT R:GTTAAACATCCCTGCCTTCA 143 203 Atr-105 F:CGATTTGATTGGCTCTTGTA R:TGCAAATAAATTGGAGCTGA 157 173 Atr-107 F:GGCAGGATTACATCTCCTGA R:TTACTAACTGCTAGATAATACCTCTCT 188 242 Atr-109 F:ACCCGAGCTGTCACATTACT R:AAAATAACGCGAATTCCTGA 162 300 Atr-114 F:GCAATTCGTGTTATGTTCATTT R:TGCATTCAGAGAATAACCGA 201 251 Atr-117 F:TGCATGACACAGGACTTACC R:TGCCTCTCAATAGCAACATC 191 259 Abr 39 F:ACCCGCAATTATTAGGAC R:CAGGACAAACTCAGACCC 178 276 Abr 40 F:TCACGCAGTCTCACAAGG R:TTCAATGGCAAACAGCAC 384 418 Abr 41 F:ACACTATCCCGCCACAAT R:CCACTGAAGCCATCATCT 322 410 Afu19 F:CATCTTAGCCGTCTGTGGTAC R:CAGGTCCCTAATACAATGGC 120 139 Afu22 F:TCCACAATCCTGAATAATGAC R:GCACCATCTAATACGAAATTG 140 242 Afu39 F:TTCTGAAGTTCACACATTG R:ATGGAGCATATTGGAAGG 119 140 Afu54 F:CTCTAGTCTTTGTTGATTACAG R:CAAAGGACTTGAAACTAGG 149 221 Afu68 F:TTATTGCATGGTGTAGCTAAAC R:AGCCCAACACAGACAATATC 128 250 DB11/T 987 2013 5 图 4 微卫星 标 记基因型 数 据 分 析结果 图 7 检测 方 法 7.1 繁殖 力检测 按照 GB 17716的生物测 定 方法。7.2 细胞遗传学特征 测 定 7.2.1 采 鲟 鱼尾 动脉血 0.5ml，加入肝素 处 理过 的 1.5mL小 指管 中，低速（1000rpm）离心 3 min，弃 上 清。用 0.8%的生 理盐 水 洗涤三次后，在 管 中 加满 70%的 冷乙醇固 定 过夜，注 意固 定 时使 细 胞 充 分 散开。7.2.2 取 细 胞 悬液浓 度 调整 到 106cell/ml样 品 1ml，用 RNA酶 10 g/ml 20 g/ml 37 水 浴消 化 0.5h；碘 化 丙碇 50 g/ml 4染 色 30min。7.2.3 将 处 理过 的 样 品 用 细 绢布过滤后，加入 适 量 的 同 样处 理 的 鸡血 红 细 胞，上流式 细 胞仪 测 定 荧光强 度，计 算 西伯利亚鲟 鱼 与 鸡血 细 胞（N=2.8pg）荧光强 度之比，即 可 得 到 鲟 鱼 的 DNA含量。7.3 生化遗传学特征 测 定 7.3.1 试验材料 西伯利亚鲟 30尾 以上。7.3.2 样品制 备 剪断 鱼 的 尾 动脉，放血。随后解剖，迅速摘取肝 组织 0.5g左 右，置 于 0 生 理盐 水 中，用生 理盐 水 洗去 组织 血污。然 后称 重，放入 玻璃匀浆器 中，按 1:5（g/ml）的 比例 加入 0.1M pH7.0的 冰 冷 磷酸缓冲 液 中 进行 冰 浴 匀浆。匀浆 后 在 4 冰箱 放置 1小 时，4 条 件 下，12000rpm离心 30min，吸 取 上 清液，分 装于 0.5ml离心管 中，-80低 温冰箱 中 保存，供 同工 酶电泳 分 析 用。7.3.3 电泳分 析 7.3.3.1 电泳 分 离 条 件：电泳 缓冲 液 0.2M tris-Gly pH8.3，分 离 胶 为 10%，浓 缩胶 为 4%，小 型 双垂直 电泳 槽 电泳电 压 100V，电泳时 间 为 9h 10h，之 后 改为 电 压 60V，电泳时 间 为 6h 7h。7.3.3.2 加 样及 电泳：每槽 加 样 7 l，与 等 体 积 的 溴酚蓝蔗糖 液 混匀 后加 样，在 4 冰箱 中 进行电泳。7.3.3.3 染 色：将-萘酚 0.1g和-萘酚 0.1g溶 解 于 10ml丙 酮 中，加 0.2M磷酸缓冲 液 至 100ml，加固 蓝 0.1g配 成 染 色 液。凝胶 板在 37 与 染 色 液，保温 30min 50min，即 可呈 现棕 红 色同工 酶 区 带，用 蒸馏 水 冲 洗 3次后，7%醋酸 固 定。7.4 分 子 遗传学标 记 方 法 表 示 西伯利亚鲟 品 种 池 表 示 非 西伯利亚鲟 样 品 DB11/T 987 2013 6 7.4.1 试验材料 从 西伯利亚鲟 群 体 中 分 别 随 机 抽 取 同龄 鱼 30尾 以上，进行 尾 椎静 脉 采 血，ACD抗凝，去 除 血 浆 后-20保存。或 剪取 西伯利亚鲟 鳍条 约 0.5g，置 于 75%酒精 中常 温保存。7.4.2 基因 组 DNA的 制 备 利用 常 规 苯酚/氯仿 法 抽 提 个 体 基 因 组 DNA，利用 紫 外 分 光光 度 法 确 定 DNA浓 度，将 个 体 基 因 组 DNA液 稀释至 浓 度 10ng/l；从 每 个个 体 基 因 组的 DNA稀释 液 中 取 出 10 l集 于 一 管 中，制 成 品 种 的 池 DNA。7.4.3 PCR扩增反应 扩增 反 应 总 体 积 为 25 l，其 中 包括 摸 板 DNA30 ng、10 PCR缓冲 液（含 Mg2+）2.5 l、dNTPS（2.5mM each）2 l、Taq酶（5u/l）0.3 l、引物 1pM（RAPD法 和 微 卫 星 DNA法分 别 使 用 各 自 的引物）。RAPD法 反 应 程 序 为：95 预 变 性 5min，94 45s、36 45s、72 90s，45cycles,72 延伸 5min。微 卫 星 DNA法 反 应 程 序 为：94 变 性 45s、退火 45s（各 引物 退火温 度 详 见表 4）、72 延伸 45s，40 cycles,72 再 延伸 5min。扩增 反 应 结 束 后，取 5 l产物与 1 l上 样 缓冲 液 混 合点样，在 含 溴 化 乙 锭 的 1.4%琼脂糖凝胶 中 电泳1h 2h，电 压 80v，紫 外 灯 下 观察 结 果 并拍 照 记录。表 4 14个微卫星 位 点 重 复序列结构 和 退火温度 位 点 名 称 重 复 序 列 结 构 退火温 度()Atr-1101(TATC)10 55 Atr-105(GATA)15 50 Atr-107(TAGA)17 57 Atr-109(GA)5(TAGA)20 55 Atr-114(TAGA)23 60 Atr-117(GATA)8 55 Abr 39(TATC)18 58 Abr 40(TCTA)6(TAGA)12 61 Abr 41(TCTA)17 65 Afu19(TTG)5 53 Afu22(TAAA)5(GAA)19 52 Afu39(CAA)14 55 Afu54(GATA)2(GACA)2 55 Afu68(GATA)21 55 7.4.4 结果 分 析 7.4.4.1 RAPD法结果 分 析 向 PCR产物 中 加入 上 样 缓冲 液，94解 链 5min，迅速置 于 冰 中 冷 却至室温，4 保存备 用。使 用 95%酒精把 长 板 擦 洗 一 遍，待 酒精 挥发 后 涂 1.5mL亲 和 溶 液；再 使 用 95%酒精把 短 板 也 擦 洗 一 遍，待 酒精 挥发 后 涂 200 L剥 离 溶 液。取 6%变 性 聚 丙 烯酰胺 溶 液 80mL，加入 60 L四甲 基 乙 二胺，180 L的 10%过 硫 酸 铵（现 用 现配），充 分 混匀 后 灌 入 两 块 玻璃 之间。用 鲨 鱼 齿梳子 的 背 面沿 两 玻璃 板 缝隙 水 平插 入DB11/T 987 2013 7 胶 中 约 5mm 6mm。等 约 1.5h待 凝胶 聚 合 后，拔 出 梳子，用 自 来 水 将 玻璃 板 表 面 冲 洗 干 净，擦 干 后 装 在 电泳 槽 上。向 电泳 槽 的 上 下 缓冲 液 槽 中 加入 0.5 TBE缓冲 液，使 缓冲 液 没 过 短 板。1800V恒 压预 电泳 20min。预 电泳 之 后，在 每 个 加 样 孔 中 加入 5 L解 链 后 样 品，1800V恒 压 电泳 1.5h 2.5h。电泳 结 束 后，小 心 分 离 两 块 玻璃 板，将 粘 有 凝胶 的长 板 浸 入染 色 液 中，染 色 5 min 15min，用 蒸馏 水 漂 洗 30s，浸 入 在 显影 液 中 显影 至 带型清 晰，再 用 蒸馏 水 漂 洗 5min。晾 干 长 板 后，拍 照 纪 录 结 果。7.4.4.2 微卫星 DNA法结果 分 析 使 用 普 通 微 卫 星 引物 进行 PCR扩增时，基 因型 判读 同上 述 RAPD法。使 用 荧光 微 卫 星 引物 进行 PCR扩增时，直 接 使 用 基 因 分 析 仪 进行 基 因型 判读。使 用 软 件 STRUCTURE 2.3对 基 因型 数据 进行 综 合 分 析。8 检测 规 则 8.1 检测 分类 检测分 为鉴定 检测 和质 量 一 致 性检测。8.2 检测项 目 鉴定 检测 项 目包括 外 部形 态 特征、可 量 性 状、可 数 性 状。质 量 一 致 性检测 项 目包括细 胞 遗传学特征、生化遗传学特征、分 子 遗传学特征。8.3 取样 样 品 鱼 的 抽样 按 GB/T 18654.2规 定 执 行。8.3.1 组 批 以同龄 期 的西伯利亚鲟 为 同 一 批。8.4 判 定规定 各 项 检测 指 标 在 标准范围 内 则 判 定为 西伯利亚鲟。DB11/T 987 2013 8 参 考 文 献 1 Ludwig A.Identification of Acipenseriformes species in trade J.Journal of Applied Ichthyology,2008,24:2-19.2 陈 细 华.鲟 形目鱼 类生物学与 资源 现 状 M.北京：海洋 出 版 社,2007:附 录 4.3 CITES.Identification Guide-Sturgeons and Paddlefish.Minister of Supply and Services,Canada.2001.4 孟庆闻,苏锦 详,缪 学 祖.鱼 类分类学 M.北京：中 国 农业出 版 社,1995.5 Billard R,Guillaume L.Biology and conservation of sturgeon and paddlefishJ.Reviews in Fish Biology and Fisheries,2001,10:355-392.6 Gisbert E,Ruban G I.Ontogenetic behavior of Siberian sturgeon,Acipenser baerii:A synthesis between laboratory tests and field dataJ.Environmental Biology of Fishes,2003,67:311-319.7 Holcik J.The freshwater fishes of Europe.V1:PartII.General introduction to fishes Acipenseriforms.AULA-Verlag Wiesbaden,1989.8 Ruban G I.The Siberian sturgeon,Acipenser Baerii Baerii,population Status in the Ob RiverJ.The Sturgeon Quarterly,1996,4(1/2):8-9.9 Ruban G I.Species structure,contemporary distribution and status of Siberian sturgeon,Acipenser baerii.Sturgeon Biodiversity and ConservationM.Dordrecht:Kluwer Academic Publishers,1997:221-230.10Vasilev V P,Sokolov L I,Serebryakova E V.Karyotype of the Siberian sturgeon Acipenser baerii Brandt from the Lena River and some questions of the acipenserid karyotypic evolutionJ.Vopr Ichthyol,1980,23:814-822._