饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定 分光光度法DB22／T 1819-2013.pdf

ICS 65.120 B 46 备案号：37938-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1819 2013 饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定 分光光度法 Determination of acidic protease activity in feed enzyme preparations Spectrophotometric method 2013-05-15发布 2013-09-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1819 2013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2009给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：吉林省产品质量监督检验院。本标准主要起草人：王伟、李媛媛、王莹、安伟、杨波。DB22/T 1819 2013 1 饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定 分光光度法 1 范围 本标准规定了饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的单位定义和测定分光光度法。本标准适用于饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所 有 的 修改 单）适用于本文件。GB/T 6682 分 析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 3 术语和定义 下列术 语 和定义适用于本文件。3.1 酸性蛋白酶活力单位 在 40、pH 3.0条 件下，酸性蛋白酶 1 min水解酪素生成 1 g酪氨 酸所 需 要的酶量 为一个 酶活力单位 U。4 原理 酸性蛋白酶 水解酪素 产 生酪氨 酸，在碱 性 条 件下 含有酚基 的 酪氨 酸 将福 林 试 剂 还原生成钼蓝与钨蓝。溶液 的 颜色与 酶 解 产 生 的 酪氨 酸的量 成正比，而酪氨 酸的 生成 量 与反 应 液 中酸性蛋白酶的活力 成正 比。用分光光度 计 测定其 吸 光度 值，根据吸 光度 值计算 酶制剂中酸性蛋白酶活力。5 试剂及材料 标准中所 有试 剂，除另有 规定 外均为 分 析纯试 剂，实 验用 水 应 符合 GB/T 6682规定的 三级以上 用 水 要 求。5.1 盐 酸。5.2 磷 酸。5.3 钨 酸 钠（Na2WO4 2H2O）。5.4 钼 酸 钠（Na2MO4 2H2O）。5.5 硫 酸 锂（Li2SO4）。5.6 溴水。5.7 无水碳 酸 钠。DB22/T 1819 2013 2 5.8 三氯乙 酸。5.9 乳 酸（80%90%）。5.10 乳 酸 钠（70%）。5.11 酪素。5.12 L-酪氨 酸标准品（含 量 99.0%）CAS：60-18-4。5.13 福 林 试 剂 于 2000 mL磨 口 回流装置 中 加入钨 酸 钠（Na2WO4 2H2O）100 g、钼 酸 钠（Na2MO4 2H2O）25 g、水 700 mL、85%磷 酸 50 mL、盐 酸 100 mL，小火沸腾回流 10 h，取 下 回流冷凝管，在通风橱 中 加入硫 酸 锂（Li2SO4）50 g、水 50 mL和 数 滴浓 溴水（99%），再微 沸 15 min，以除 去多余 的 溴（冷 后仍 有 绿 色需 再 加溴水，在 煮 沸除 去过 量的 溴），冷 却转移至 1000 mL容 量 瓶 中，加水 定 容至刻 度。混匀，过滤。制 得 的 试 剂应 呈金黄 色，储存 于 棕 色 瓶 中 内。5.14 福 林 工作 溶液 取一 份 福 林 试 剂 与 两份 水 混 合，摇匀即 为福 林 工作 溶液。5.15 碳 酸 钠溶液（0.4 mol/L）称 取无水碳 酸 钠 42.4 g，用 水溶解 并定 容至 1000 mL。5.16 三氯乙 酸 溶液（0.4 mol/L）称 取无水三氯乙 酸 65.4 g，用 水溶解 并定 容至 1000 mL。5.17 盐 酸 溶液（0.1 mol/L）量 取盐 酸 9 mL，用 水溶解 并定 容至 1000 mL。5.18 盐 酸 溶液（1 mol/L）量 取盐 酸 90 mL，用 水溶解 并定 容至 1000 mL。5.19 乳 酸 缓冲（pH 3.0）甲 液 称 取乳 酸 10.6 g，加水溶解 并定 容至 1000 mL。乙液 称 取乳 酸 钠 16 g，加水溶解 并定 容至 1000 mL。取 甲 液 8 mL、乙液 1 mL混 合，加水 9 mL稀释，摇匀即 为 pH 3.0的 乳 酸 缓冲 溶液。5.20 酪素溶液（10 g/L）称 取酪素 1.0g 置 研钵 中（精确至 0.0001 g），加乳 酸 2 3滴湿润，研 磨 3 min，加入 15 mL乳 酸 缓冲 溶液，静 置，将上 清 液 转移至 100 mL容 量 瓶 中。残渣继续研 磨 至 少 3 min，加入 10 mL乳 酸 缓冲 溶液，静 置，将上 层清 液 转移至容 量 瓶 中，如此 反 复至 少 3 次，将酪素 全部转移至容 量 瓶 中。在沸水 浴 中 加 热 至完全 溶解，冷 却后 用 乳 酸 缓冲 液 定 容至刻 度。该 溶液在 4 贮存，有 效 期 3 d。5.21 L-酪氨 酸标准 贮备 溶液 称 取 预先 于 105 干燥至恒重 的 L-酪氨 酸 0.1 g（精确至 0.001 g），用 1 mol/L 的 盐 酸 溶液 60 mL溶解 后 定 容至 100 mL容 量 瓶 中，即 为 1 mg/mL酪氨 酸标准 贮备 溶液，该 溶液在 4 贮存，有 效 期 3 d。5.22 L-酪氨 酸标准 溶液 准 确 量 取 1 mg/mL酪氨 酸标准 贮备 溶液 10.0 mL置 100 mL容 量 瓶 中，用 0.1 mol/L盐 酸定 容至刻 度，即得到 100 g/mL L-酪氨 酸标准 溶液，该 溶液 现 用 现配。6 仪器 6.1 紫 外-可 见 分光光度 计。6.2 分 析 天平：感 量 0.0001 g。6.3 酸度 计：精确至 0.01。6.4 电 加 热器。DB22/T 1819 2013 3 6.5 研钵。6.6 恒温 水 浴摇床：温控范围 30 60，精 度 0.2。6.7 比色管：25 mL。6.8 秒表。7 分析步骤 7.1 样品制备 称 取 适量 试 样（精确至 0.001 g）置 研钵 中，用少量 乳 酸 缓冲 液（5.19）润湿，研 磨 至 少 3 min，加入 15 mL乳 酸 缓冲 液（5.19）混匀，静 置，将上 层清 液 转移至 100 mL容 量 瓶 中。沉渣部 分 继续重复 上 述操作至 少 3次，将试 样全部转移 入 容 量 瓶 中，用 乳 酸 缓冲 液（5.19）定 容至刻 度，摇匀。根据 酶活力用 乳 酸 缓冲 液（5.19）稀释至 适 当浓 度，供 测 试 样（酶活力应 控 制 在 8 U/mL10 U/mL范围内）。7.2 样品测定 7.2.1 样品空白测定溶液 准 确 量 取上 述 测定 溶液（混 悬 溶液，摇匀后 立 即 量 取）1.0 mL于 25 mL 比色管 中，置 温 度 40 0.2、振 摇 速 度 100次/min的 水 浴摇床 中 预热 2 min，加入 2.0 mL三氯乙 酸 溶液（5.16），摇匀，再 置水 浴 摇床 中 保 温 10 min（准 确 计 时）。取 1.0 mL 酪素溶液（5.20）加入上 述 比色管 中，摇匀，静 置 10 min，用定量 滤 纸 过滤，滤 液 备 用。准 确 量 取 滤 液 1.0 mL置 于 另一比色管 中，加 5.0 mL碳 酸 钠溶液（5.15），加 1.0 mL福 林 工作 溶液（5.14），置 温 度 40 0.2 的 水 浴摇床 中 显 色 20 min（准 确 计 时），作 为 样 品 空 白测 试溶液。7.2.2 样品测定溶液 准 确 量 取上 述 测定 溶液（混 悬 溶液，摇匀后 立 即 量 取）1.0 mL于 25 mL 比色管 中，置 温 度 40 0.2、振 摇 速 度 100次/min的 水 浴摇床 中 预热 2 min，加 1.0 mL酪素溶液（5.20），摇匀，再 置水 浴摇床 中 保 温 10 min（准 确 计 时）。取 2.0 mL三氯乙 酸 溶液（5.16）加入上 述 比色管 中，摇匀，静 置 10 min，用定量 滤 纸 过滤，滤 液 备 用。准 确 量 取 滤 液 1.0 mL置 于 另一比色管 中，加 5.0 mL碳 酸 钠溶液（5.15），加 1.0 mL福 林 工作 溶液（5.14），置 温 度 40 0.2 的 水 浴摇床 中 显 色 20 min（准 确 计 时），作 为 样 品测 试溶液。7.2.3 绘制 L-酪 氨基酸标准曲线 准 确 量 取 L-酪氨 酸标准 溶液（5.21）0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分 别 置 于 6只 10 mL容 量 瓶中，加水 定 容至 10 mL，即浓 度 为 0、10、20、30、40、50 g/mL的标准 工作 溶液。分 别 取 L-酪氨 酸标准 工作 溶液 1.0 mL置 于 另外 6只 25 mL 比色管 中，各 加 5.0 mL碳 酸 钠溶液（5.15）和 1.0 mL福 林 工作 溶液（5.14）mL，置 40 0.2水 浴摇床 中 显 色 20 min（准 确 计 时），作 为 标准测 试溶液。以 0浓 度标准测 试溶液为 参 比，在 680 nm 波 长处 分 别 测定其 吸 光度。以吸 光度 A为 横坐 标，酪氨 酸的 浓 度 C为 纵坐 标，计算 出标准 曲线 回 归 方 程。7.2.4 测定 以 0浓 度标准测 试溶液为 参 比，在 680 nm波 长处 测定 样 品 空 白测 试溶液 和 样 品测 试溶液 的 吸 光度，用标准 曲线 回 归 方 程 计算 出对应的 L-酪氨 酸量，该 溶液 能够保持稳 定 至 少 2 h。DB22/T 1819 2013 4 7.3 结果计算与表述 7.3.1 结果计算 酸性蛋白酶活力按（1）式 计算：mn wX=10.(1)式 中：X 酶活力单位，U/g;w 用 回 归 方 程 计算 出的 试 样 溶液 相 当 的 L-酪氨 酸量，g；n 试 样 溶液 总 稀释 倍 数；10 酶 反 应 时间，min；m 试 样 质量，g。8 精密度 两平 行 测定 结果 的 允许相 对 偏差 不 大 于 3.0%。_