饲料中己烯雌酚的测定 液相色谱-质谱质谱法DB22／T 1987-2013.pdf

ICS 65.120 B 46 备案号：DB22 吉林省 地方标准 DB22/T 1987 2013 饲料中己烯雌酚的测定液相色谱-质谱/质谱法 Determination of diethylstilbestrol in feeds LC-MS/MS method 2013-12-18发布 2013-12-31实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1987 2013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009和 GB/T 20001.4 2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：吉林省产品质量监督检验院、顺德出入境检验检疫局。本标准起草人：刘斌、邵秋荣、史艳宇、王宇、王潇、王家旭、石金娥、李滢倩、李媛媛。DB22/T 1987 2013 1 料饲料中己烯雌酚的测定液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中己烯雌酚含量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本标准适用于饲料中己烯雌酚含量的测定。本方法检出限为 0.01 mg/kg。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可 少 的。凡 是 注日期 的 引 用文件，仅所注日期 的 版 本适用于本文 件。凡 是不 注日期 的 引 用文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法 GB/T 20195 动物 饲料 试样 的 制备 3 原理 试 料用 乙腈 提 取，经阴离子固 相 萃取柱净化、浓缩后，液相色谱-质谱/质谱（HPLC-MS/MS）测定，外 标法定量。4 试剂与材料 除另有 规定 外，所有试剂均 为 分析纯，实 验用 水符合 GB/T 6682规定 一级水 的标准。4.1 氢氧化钠（NaOH）。4.2 甲醇(CH3OH)。4.3 甲酸(HCOOH)。4.4 乙腈(CH3CN)：色谱 纯。4.5 氨水(NH4OH)：浓度 25%28%。4.6 氢氧化钠溶 液（0.01 mol/L）：称取 0.4 g氢氧化钠（4.1），用 水 定 容至 1 L。4.7 70%甲醇溶 液：量 取 70 mL甲醇（4.2），用 水 定 容至 100 mL。4.8 氨水溶 液：氨水-水（1+19，体积比）。4.9 甲酸甲醇溶 液：甲酸-甲醇（1+19，体积比）。4.10 己烯雌酚（diethylstilbestrol）标准品：C18H20O2，CAS：56-53-1，纯度 99.0%。4.11 标准 储备 液（1.0 mg/mL）：准 确称取 0.0100 g己烯雌酚标准品，用 甲醇 定 容至 10.0 mL。4 条 件下 避光保存，可 使 用 1个月。4.12 标准 工作 液：取 标准 储备 液（4.11）用 70%甲醇溶 液（4.7）稀释，配制成浓度依次 为 0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L的己烯雌酚标准 溶 液，根据需 要 用 2.0 mL适 当 浓度 的 标准 溶 液 溶 解空白 样 品 浓缩 残渣，配制成 相应 浓度 的标准 工作溶 液，现 用 现 配。4.13 弱 阴离子 交换 固 相 萃取柱：60 mg/3 mL，或 相 当者。DB22/T 1987 2013 2 4.14 滤膜：0.22 m，有 机 相。5 仪器和设备 5.1 液相色谱-质谱/质谱 仪：配有 电喷雾（ESI）离子 源。5.2 离 心机：转速 8000 r/min。5.3 天平：感 量 0.0001 g。5.4 超声波清洗器：40 kHz。5.5 固 相 萃取 装置。5.6 氮吹仪。6 分析步骤 6.1 试样制备 选 取有 代表性 饲料 样 品 至少 500 g，按 GB/T 20195 制备样 品。6.2 提取 称取 5 g粉碎 试样（精 确 到 0.001 g）于 50 mL离 心管 中，加 入 40 mL乙腈（4.4），混匀，超声 提 取 15 min，5000 r/min 离 心 10 min，上清 液 转移 至另一 50 mL离 心管 中；残渣 中 加 入 10 mL乙腈 再 次 提 取，合 并 两 次 提 取溶 液，40 下 旋转蒸发 至 近干，加 5 mL氢氧化钠溶 液（4.6）溶 解残渣，8000 r/min离 心5min，取 上清 液，待 净化。6.3 净化 将 阴离子固 相 萃取柱 连接 于 真空 固 相 萃取 装置 下，先 用 2 mL甲醇（4.2）、2 mL水 将 柱子 活 化，将6.2的 样 品 上清 液 上 柱，流速 为 1 mL/min，依次 用 1 mL氨水溶 液(4.8)、0.5 mL甲醇 以 3 mL/min的 流速淋 洗，用 4 mL甲酸甲醇溶 液(4.9)洗脱，流速 为 1 mL/min。收集洗脱 液，在 40 下 经 氮气吹干 后，用 2 mL70%甲醇溶 液（4.7）溶 解残渣，过 0.22 m滤膜（4.14），供 HPLC-MS/MS测定。6.4 测定 6.4.1 液相色谱参考条件：a）色谱 柱：C18柱,5 m，150 mm 2.1 mm，或 相 当者；b）流 动 相：V（水）+V（乙腈）=43+57；c）流速：0.3 mL/min；d）进 样 量：5 L；e）柱 温：30。6.4.2 质谱参考条件：a）离子 源：电喷雾（ESI），负 离子 模式；b）离子 喷雾电压：4 kV；c）雾 化 气：氮气，0.25 MPa；d）干燥器：氮气，流速 10 L/min，温 度 325；e）扫描 方 式：多反 应监测（MRM）；DB22/T 1987 2013 3 f）监测 离子：母 离子 m/z 267.1，定量 子离子 m/z 251.1，定 性 子离子 m/z 237.1；g）驻留时间：0.5 s；h）脱 溶剂 气、锥孔气 为 氮气，碰 撞 气 为 高 纯 氮气；使 用 前 应 调节各 气 体 流 量 以 使 质谱 灵敏 度 达 到检测 要 求；锥孔电压、碰 撞能 量 等 电压 值 应 优 化至最 优灵敏 度。6.4.3 液相色谱-质谱/质谱测定 6.4.3.1 定性测定 各 检测 目 标 化合物 以 保 留时间 和 两 对 离子（定 性 离子/定量 离子）所 对应的 LC-MS/MS色谱 峰面 积 相 对 丰 度 进 行 定 性。被 测 试样 中 目 标 化合物 的 保 留时间 与 标准 溶 液中 目 标 化合物 的 保 留时间 一 致，同 时 被测 试样 中 目 标 化合物 的定 性 离子 相对 丰 度 与 浓度 接近 的相 同 条 件下 得 到 的标准 溶 液谱 图 相 比，误差 不 超过表 1规定的 范围，则可 判 定 样 品中 存 在 对应的 被 测 物。表 1 定 性 确 证 时 相对 离子 丰 度 的 最 大允许误差 相对 离子 丰 度 50%20 50%10 20%10%允许 的相对 误差 20%25%30%50%6.4.3.2 定量测定 以 标准 工作溶 液（4.12）浓度 对定量 离子 峰面 积 绘 制 标准 曲线，待 测 样 液中己烯雌酚的 响 应 值 应 在标准 曲线线 性 范围内，超过 线 性 范围 则应 稀释后 再进 样分析，外 标法定量。在上 述 色谱 条 件下，己烯雌酚标准 物 质的 多反 应监测（MRM）色谱 图参见附录 A。7 结果计算 测定 结果 可由 仪器 工作 站自 动 计算，也 可按 式（1）计算：1000 1000cVXm=.(1)式 中：X 样 品中己烯雌酚的 总 量，单位为 毫克每千克（mg/kg）；c 由标准 曲线计算得 试 液中己烯雌酚的 浓度，单位为 毫克每升（mg/L）；V 样 品 最 终 定 容体积，单位为 毫升（mL）；m 样 品 取样 质量，单位为 克（g）；结果 保 留两 位 有 效数字。8 精密度 8.1 重复性 在 重复 性 条 件下 获得 的 两 次 独立 测定 结果 的 绝 对 差值 不 得 超过 算 术 平 均 值 的 15%。8.2 再现性 在再现性 条 件下 获得 的 两 次 独立 测定 结果 的 绝 对 差值 不 得 超过 算 术 平 均 值 的 15%。DB22/T 1987 2013 4 A A 附 录 A（资料性附录）己烯雌酚的 MRM质量色谱谱图 A.1 己烯雌酚标准物质 MRM总离子流图和选择离子流图 见 图 A.1。图 A.1 1.0 mg/L己烯雌酚标准 溶 液 MRM色谱图 _