资源描述
ICS 65.120 B 04 备案号：35745-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1617 2012 饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和 隐色结晶紫的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of malachite green、leucomalachite green、crystal violet and leucocrystal violet in feeds HPLC-MS/MS method 2012-12-01发布 2013-01-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1617 2012 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心、珲春出入境检验检疫局技术中心、白 城出入境检验检疫局技术中心。本标准主要起草人：康明芹、张琦、张勋、冯博、孟日增、杨帆、张代辉、胡婷婷。DB22/T 1617 2012 1 饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本标准适用于饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的测定和确证。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是 注 日 期 的 引 用文件，仅注 日 期 的 版 本适用于本文件。凡是不 注 日 期 的 引 用文件，其最新版 本(包括所有 的 修改 单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法。3 原理 试样经乙腈-乙酸铵缓冲溶 液提 取，二氯甲烷 和 水 液液 萃取，再经 中 性氧化铝固 相 萃取小柱净化，液 相色谱-质谱/质谱 仪 测定，外 标法定 量。4 试剂和材料 除另有说 明 外，所 用 试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682规定的 一级水。4.1 无水乙酸铵(CH3COONH4)：优级纯。4.2 盐酸羟胺(HONH3Cl)。4.3 对-甲苯磺酸（C7H8O3S）。4.4 标准 物 质：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐色结晶紫（LCV）纯度均98%。标准 物 质 信息参见附录 A。4.5 乙腈（CH3CN）：色谱 纯。4.6 甲酸（HCOOH）：色谱 纯。4.7 二氯甲烷（CH2Cl2）：优级纯。4.8 冰醋酸（CH3COOH）：优级纯。4.9 0.1 mol/L乙酸铵缓冲溶 液：称取 1.54 g无水乙酸铵溶解 于 200 mL水 中，混匀，并用 冰醋酸调 pH值到 4.5。DB22/T 1617 2012 2 4.10 0.25 g/mL盐酸羟胺溶 液：称取 25.0 g盐酸羟胺，用 水溶解 并定 容至 100 mL。4.11 1.0 mol/L对-甲苯磺酸溶 液：称取 17.2 g对-甲苯磺酸，用 水溶解 并定 容至 100 mL。4.12 0.1%甲酸溶 液：取 1.0mL甲酸(4.6)，用 水稀释 并定 容至 1 000 mL。4.13 样品 定 容 液：乙腈-0.1%甲酸溶 液(8+2)。量取 80 mL乙腈(4.5)与 20 mL的 0.1%甲酸溶 液(4.12)，混匀。4.14 标准 储备 液：0.1 mg/mL。准确 称取 适 量 的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫标准 物 质（4.4），分别 用少 量乙腈溶解 并 转移至 100 mL容量 瓶 中，分别 用 乙腈 定 容至 刻 度，混匀。4.15 标准 工作 液：10.0 g/L。首先 分别 准确 吸 取 上述四种硝基呋喃 代 谢 物 标准 储备 液（4.14）用 乙腈稀释 成 1.0 mg/L的 溶 液，然后从 中准确 吸 取 1.0 mL于 100 mL容量 瓶 中，用 样品 定 容 液 稀释 并定 容至 刻 度，混匀。4.16 中 性氧化铝固 相 萃取小柱：500 mg/6 mL，使 用 前 用 10 mL乙腈 预处理。4.17 滤膜：0.22 m，有 机系。5 仪器与设备 5.1 液相色谱-串联 质谱 仪：配 备 电喷雾离子源（ESI）。5.2 高速 匀 浆机。5.3 旋 转 蒸发 仪。5.4 天平：感 量 0.0001 g和 0.01 g。5.5 高速离 心 机：10 000 r/min。5.6 涡旋 混 合器。5.7 聚丙烯离 心 管：50 mL。5.8 超声波清洗器：40 kHz。5.9 0.28 mm孔 筛。6 试样制备 取有 代 表 性样品，粉碎，过 0.28 mm筛，混匀备 用。7 测定步骤 7.1 提取 称取 2 g试样（精 确 至 0.01 g）于 50 mL离 心 管 中，依次加 入 1 mL乙酸铵缓冲溶 液（4.9）、1 mL盐酸 羟胺溶 液（4.10）、1 mL对-甲苯磺酸溶 液（4.11）和 24 mL乙腈，高速 匀 浆 2 min，10 000 r/min离 心 4 min，将上清 液 转移至 500 mL分 液 漏斗 中。剩余残渣 用 20 mL乙腈 重复 提 取一 次，合 并 上清 液。于 分 液 漏斗 中DB22/T 1617 2012 3 加 入 30 mL二氯甲烷、20 mL水，振摇 2 min，静止 分 层，收集 下 层 有 机 相于 250 mL浓缩瓶 中，再 用 20 mL二氯甲烷 重复 萃取一 次，合 并下 层 有 机 相，40 旋 转 蒸发 至 近干。7.2 净化 将上述浓缩瓶 中 残渣 用 10 mL乙腈分 三次（每次约 3 mL）超声 溶解，并 依次通过预处理过 的中 性氧 化铝固 相 萃取小柱（4.16），收集洗脱 液。再 用 20 mL乙腈分 四次进行洗脱，合 并 洗脱 液于 鸡 心 瓶 中，40 旋 转 蒸发 至 干，用 乙腈-0.1%甲酸溶 液（4.13）定 容至 1 mL，过 0.22 m滤膜，滤 液 供 LC-MS/MS测定。7.3 混合基质标准溶液的制备 称取 7份 2 g（精 确 至 0.01 g）阴 性试样 于 50 mL离 心 管 中，操 作 同 7.1和 7.2至“用 乙腈-0.1%甲酸 溶 液（4.12）定 容至 1 mL，过 0.22 m滤膜”后 分别 加 入少 量 标准 溶 液 使浓 度分别为 1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 g/L，供 LC-MS/MS测定。7.4 空白试验 除 不 称取试样外，均 按 7.1、7.2进行。7.5 测定 7.5.1 色谱参考条件 色谱 参 考条 件 如 下：a)色谱 柱：C18，2.1mm 150 mm，3.5 m；b)柱 温：室 温；c)流 速：0.25 mL/min；d)进 样量：10 L；e)流动 相：乙腈-0.1%甲酸溶 液（8+2）。7.5.2 质谱参考条件 质谱 参 考条 件 如 下：a)电离 方 式：电喷雾电离（ESI）；b)扫描 方 式：正 离子 扫描；c)检测方 式：多反 应 监 测（MRM）；d)电离电 压：3 kV5 kV；e)脱 溶剂 气：0.21 MPa；f)雾 化 气：0.24 MPa；g)辅助气：0.35 MPa；h)碰撞气：0.15 MPa；i)离子源 温 度：300 550.0；j)定 性 离子 对、定 量 离子 对、去簇 电 压、碰撞能 量见 表 1。DB22/T 1617 2012 4 表 1 目标化合物的监测离子对、去簇电压和碰撞能量 化 合 物 名 称 母 离子 m/z 子离子 m/z 去簇 电 压 V 碰撞能 量 V 208 80 52 孔雀石绿 329 313*80 48 239*80 47 隐色孔雀石绿 331 315 80 44 340 80 70 结晶紫 372 356*80 52 239 80 47 隐色结晶紫 374 358*80 44 注：带“*”的 为 定 量 离子。7.5.3 定性分析 在同 一 色谱/质谱 条 件下 进行 标准 溶 液和 样品溶 液的测定，如果 样品溶 液中检出的色谱 峰 的 保留时 间 与 标准 物 质色谱 峰 的 保留时间 一 致，所 选择 的 两 对 子离子 的质 荷比也 一 致，而且 样品 定 性 离子 的相对丰 度与 浓 度 相 当 标准 工作 溶 液的定 性 离子 的相对 丰 度 相 比较，相对标准 偏差 不 超过表 2规定的 范围，则 可 判 定 样品 中 存在该 物 质。标准 溶 液的 多反 应 监 测色谱 图 参见附录 B。表 2 定性 确证时 相对离子 丰度 的 最大允许偏差 相对 离子 丰 度 50%20%至 50%10%至 20%10%允许 的相对 偏差 20%25%30%50%7.5.4 定量测定 根据 试样 中 被 测 样 液中 被 测 组 分 的 含 量 情况，选 取 响 应 值 相 近 的标准 工作 液 进行 分析，对于 高浓 度样品 须 适 当 进行系 列 稀释。标准 工作 液和 样 液中 被 测 组 分 的 响 应 值均 应 在 仪 器 线 性 响 应 范围内。在 上述色谱 条 件下，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的 参 考保留时间 为 4.43 min7.43 min，外标法定 量。标准 溶 液的 多反 应 监 测色谱 图 参见附录 B。8 结 果计算 和表 述 按（1）式计算 试样 中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫 残 留 量 含 量，计算 结 果需扣 除 空 白 值。mV cXii=.(1)式 中：X i 试样 中 被 测 组 分 残 留 量，单位 为 微克 每 千克(g/kg)；ci 从 标准 曲线读 出的 被 测 组 分溶 液 浓 度，单位 为 微克 每 升（g/L）；V 样 液 最 终 定 容 体积，单位 为 毫升(mL)；DB22/T 1617 2012 5 m 样 液 所 代 表 的 最 终 试样 的质 量，单位 为 克(g)。计算 结 果 表 示 到小 数点 后 一 位。9 定量 限、回收率 和 精密度 9.1 定量 限 本标准方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的定 量 限 均为 0.5 g/kg。9.2 回收率及精密度 在 重复 性 条 件下 获得 的 两 次 独立 测 试 结 果 的 绝 对 差 值 不 大 于 这 两 个 测定结 果 的 算 术 平 均值 的 15%。样品 中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的 添 加浓 度 及 其 回 收 率、精 密 度实 验 数据 参 见附录 C。DB22/T 1617 2012 6 A A 附 录 A（资 料性 附录）标准物质 信息 表 A.1 标准物质 CAS号、分子 式及 分子量 化 合 物 名 称 CAS号 分 子 式 分 子 量 孔雀石绿草 酸盐 2437-29-8 C52H54N4O12 927.01 隐色孔雀石绿 129-73-7 C23H26N2 330.47 结晶紫 盐酸盐 548-62-9 C25H30N3Cl 407.98 隐色结晶紫 603-48-5 C25H31N3 373.53 DB22/T 1617 2012 7 B B 附 录 B（资 料性 附录）标准溶液 多反应 监测（MRM）色谱 图 图 B.1 标准溶液 多反应 监测（MRM）色谱 图（4种 标液 均为 5.0 g/L）DB22/T 1617 2012 8 C C 附 录 C（资 料性 附录）不同添加水平平均回收率及精密度（n=10）表 C.1 不同添加水平平均回收率及精密度 化 合 物 名 称 样品 名 称 添 加浓 度 mg/kg 回 收 率 范围%相对标准 偏差%1.0 83.0 100 5.49 2.0 88.0 95.5 2.90 配合 饲料 10 92.6 99.3 1.93 1.0 87.0 97.0 3.61 2.0 42.0 51.0 5.58 预 混 饲料 10 96.5 102 1.40 1.0 79.0 106 8.43 2.0 89.5 102 3.72 浓缩 饲料 10 92.1 96.9 1.73 1.0 86.0 102.0 6.05 2.0 84.5 94.5 3.15 孔雀石绿 鱼 粉 10 94.8 98.2 1.04 1.0 60.0 69.0 4.32 2.0 62.5 70.5 3.81 配合 饲料 10 60.5 65.2 2.29 1.0 61.0 71.0 4.84 2.0 62.5 69.5 3.43 预 混 饲料 10 60.1 64.9 2.25 1.0 61.0 68.0 4.15 2.0 60.5 69.0 4.12 浓缩 饲料 10 60.7 63.9 1.46 1.0 61.0 67.0 2.70 2.0 63.5 70.5 2.98 隐色孔雀石绿 鱼 粉 10 60.5 65.7 2.22 1.0 87.0 102 5.18 2.0 84.5 98.0 3.76 配合 饲料 10 95.4 102 1.72 1.0 89.0 99.0 3.07 2.0 93.0 96.5 1.16 预 混 饲料 10 94.8 99.8 1.55 1.0 87.0 97.0 3.03 结晶紫 浓缩 饲料 2.0 88.5 97.5 3.09 DB22/T 1617 2012 9 C.1 不同添加水平平均回收率及精密度(续)10 95.8 99.1 1.07 1.0 86.0 104.0 5.80 2.0 83.5 99.0 6.48 鱼 粉 10 94.6 99.2 1.56 1.0 60.0 67.0 3.55 2.0 61.5 65.5 1.85 配合 饲料 10 61.5 63.4 0.96 1.0 60.0 66.0 2.79 2.0 60.5 63.5 1.85 预 混 饲料 10 61.2 63.4 1.08 1.0 61.0 67.0 3.14 2.0 60.5 64.0 1.96 浓缩 饲料 10 60.5 65.2 2.39 1.0 61.0 71.0 5.44 2.0 60.5 64.5 1.86 隐色结晶紫 鱼 粉 10 61.1 64.8 1.61 _
展开阅读全文