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I C S 1 1.2 2 0B 4 1备 案 号：DB42湖 北 省 地 方 标 准D B 4 2/T 7 9 3 2 0 1 2口 蹄 疫 病 毒 非 结 构 蛋 白 抗 体 酶 联 免 疫 吸 附试 验 检 测 方 法E n z y m e-l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y t o d e t e c t a n t i b o d y a g a i n s t n o n s t r u c t u r e p r o t e i no f f o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e v i r u s2 0 1 2-0 1-0 6 发 布 2 0 1 2-0 3-0 1 实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局发 布D B 4 2/T 7 9 3 2 0 1 2I目 次前 言.I I引 言.I I I1 范 围.12 缩 略 词.13 实 验 原 理.14 实 验 条 件.15 实 验 材 料.26 实 验 方 法.27 结 果 判 定.38 注 意 事 项.3附 录 A.4附 录 B.6D B 4 2/T 7 9 3 2 0 1 2I I前 言本 标 准 按 G B/T 1.1-2 0 0 9 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口。本 标 准 起 草 单 位：华 中 农 业 大 学 动 物 医 学 院、武 汉 科 前 动 物 生 物 制 品 有 限 责 任 公 司、湖 北 省 动 物 疫病 预 防 控 制 中 心。本 标 准 主 要 起 草 人：吴 斌、金 梅 林、钱 平、曹 胜 波、陈 焕 春、卢 顺、李 淑 云、宋 念 华。D B 4 2/T 7 9 3 2 0 1 2I I I引 言口 蹄 疫(F o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e,F M D)是 偶 蹄 动 物 的 一 种 急 性、高 度 接 触 性 传 染 病，其 病 原 是 口 蹄 疫病 毒。该 病 传 播 途 径 多，传 染 性 强，发 病 率 高，曾 多 次 在 世 界 上 发 生 过 大 流 行。世 界 动 物 卫 生 组 织（O I E）将 本 病 列 为 必 报 传 染 病 之 首，我 国 将 其 列 为 一 类 动 物 疫 病。本 标 准 的 检 测 技 术 参 考 O I E 诊 断 试 验 和 疫 苗 标 准 手 册（2 0 0 9 版）2.1.5 章 中 推 荐 的 方 法，并 结合 起 草 单 位 在 口 蹄 疫 血 清 学 诊 断 技 术 方 面 的 研 究 基 础 编 写 制 定。本 文 件 的 发 布 机 构 提 请 注 意，声 明 符 合 本 文 件 时，可 能 涉 及 到 一 种 口 蹄 疫 病 毒 非 结 构 蛋 白 基 因3 A B C 及 其 制 备 方 法 与 应 用（专 利 号：Z L 2 0 0 3 1 0 1 0 0 1 1 4 5）相 关 的 专 利 的 使 用。本 文 件 的 发 布 机 构 对 于 该 专 利 的 真 实 性、有 效 性 和 范 围 无 任 何 立 场。该 专 利 持 有 人 已 向 本 文 件 的 发 布 机 构 保 证，他 愿 意 同 任 何 申 请 人 在 合 理 且 无 歧 视 的 条 款 和 条 件 下，就 专 利 授 权 许 可 进 行 谈 判。该 专 利 持 有 人 的 声 明 已 在 本 文 件 的 发 布 机 构 备 案。相 关 信 息 可 以 通 过 以 下 联系 方 式 获 得：专 利 持 有 人 姓 名：陈 焕 春、顾 贫、曹 胜 波、钱 平、唐 勇、金 梅 林、吴 斌、方 六 荣、刘 正 飞、吕 建 强。地 址：武 汉 市 洪 山 区 狮 子 山 街 1 号 华 中 农 业 大 学邮 政 编 码：4 3 0 0 7 0联 系 电 话：0 2 7-8 7 2 8 2 6 0 8传 真：0 2 7-8 7 2 8 2 6 0 8请 注 意 除 上 述 专 利 外，本 文 件 的 某 些 内 容 仍 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利的 责 任。D B 4 2/T 7 9 3 2 0 1 21口 蹄 疫 病 毒 非 结 构 蛋 白 抗 体 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 口 蹄 疫 病 毒 非 结 构 蛋 白 抗 体 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 检 测 方 法 的 缩 略 词、实 验 原 理、实 验 条件、实 验 材 料、实 验 方 法、结 果 判 定 和 注 意 事 项 等。本 标 准 适 用 于 检 测 猪 血 清 中 口 蹄 疫 病 毒 非 结 构 蛋 白 的 抗 体。2 缩 略 词下 列 缩 略 词 适 用 于 本 标 准。E L I S A（e n z y m e-l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y）：酶 联 免 疫 吸 附 试 验F M D V(f o o t-a n d-m o u t h d i s e a s e v i r u s)：口 蹄 疫 病 毒O D 6 3 0 n m 值：6 3 0 纳 米 波 长 处 的 吸 光 值S：样 品 孔 O D 6 3 0 n m 值P：阳 性 对 照 孔 O D 6 3 0 n m 平 均 值3 实 验 原 理口 蹄 疫 感 染 动 物 体 内 产 生 口 蹄 疫 病 毒 结 构 蛋 白 抗 体 和 非 结 构 蛋 白 抗 体，而 口 蹄 疫 疫 苗 免 疫 动 物 主 要产 生 结 构 蛋 白 抗 体，因 此 可 以 通 过 检 测 非 结 构 蛋 白 的 抗 体 来 区 分 疫 苗 免 疫 动 物 和 野 毒 感 染 动 物。在F M D V 各 蛋 白 的 抗 体 中，非 结 构 蛋 白 的 抗 体 是 检 测 F M D V 感 染 的 最 可 靠 指 标。F M D V 非 结 构 蛋 白 抗 体 E L I S A 检 测 技 术 是 利 用 待 检 样 品 中 的 抗 体 与 包 被 在 酶 标 板 上 的 重 组 非 结 构蛋 白 抗 原 发 生 反 应，然 后 通 过 洗 涤 把 抗 原 抗 体 复 合 物 和 其 他 物 质 分 开；再 加 入 酶 标 记 抗 体（酶 标 二 抗），酶 标 记 抗 体 也 可 以 通 过 反 应 与 抗 原 抗 体 复 合 物 结 合，此 时 酶 标 板 上 的 酶 量 与 样 品 中 的 抗 体 量 成 正 比；加入 底 物 后，底 物 被 酶 催 化 成 有 色 产 物，有 色 产 物 的 量 与 样 品 中 抗 体 的 量 直 接 相 关，故 可 根 据 O D 6 3 0 n m 值进 行 分 析。4 实 验 条 件4.1 实 验 室实 验 操 作 宜 在 常 温（1 8 2 5）进 行。4.2 仪 器台 式 低 温 高 速 离 心 机、微 量 移 液 器、冰 箱、恒 温 箱、酶 标 检 测 仪。4.3 人 员注 意 个 人 防 护 和 环 境 保 护。D B 4 2/T 7 9 3 2 0 1 225 实 验 材 料口 蹄 疫 病 毒 重 组 非 结 构 蛋 白、酶 标 记 抗 体、阳 性 对 照 血 清、阴 性 对 照 血 清；包 被 液、封 闭 液、样 品稀 释 液、洗 涤 液、底 物 液 A、底 物 液 B、终 止 液；试 剂 配 方 见 附 录 A。6 实 验 方 法6.1 样 品 处 理取 猪 血 液，待 血 液 凝 固 后，4 0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n，收 集 血 清。血 清 宜 清 亮，无 严 重 溶 血。具 体 血液 采 集 与 样 品 处 理 的 注 意 事 项 见 附 录 B。6.2 包 被用 包 被 液 将 抗 原 稀 释 到 工 作 浓 度（3.1 g/m L）加 入 酶 标 板 孔 内，每 孔 1 0 0 L，在 2 8 下 包被 1 4 h。6.3 封 闭取 出 抗 原 包 被 板，弃 去 孔 中 的 包 被 液，拍 干；每 孔 加 洗 涤 液 2 0 0 L，静 置 3 m i n；弃 去 洗 涤 液，加封 闭 液，2 0 0 L/孔，于 3 7 封 闭 2 h；弃 去 封 闭 液，拍 干。于 2 8 冷 藏 过 夜，自 然 干 燥。6.4 样 品 稀 释用 血 清 稀 释 液 按 1:4 0 的 比 例 稀 释 血 清 样 品（1 9 5 L 样 品 稀 释 液 中 加 5 L 血 清 样 品），用 血 清 稀 释 液按 1：4 的 比 例 稀 释 对 照 血 清（1 8 0 L 样 品 稀 释 液 中 加 6 0 L 对 照 血 清），轻 轻 振 荡 混 匀。6.5 加 样将 稀 释 好 的 待 检 血 清 和 对 照 血 清 各 取 1 0 0 L 加 入 到 抗 原 包 被 板 孔 中，待 检 血 清 作 1 孔，阴 性 对 照 和阳 性 对 照 各 作 2 孔，轻 轻 振 匀 孔 中 样 品（勿 溢 出），置 3 7 下 温 育 3 0 m i n。6.6 洗 涤弃 掉 板 孔 中 的 溶 液，用 洗 涤 液 洗 板 5 次，2 0 0 L/孔，每 次 静 置 3 m i n 后 倒 掉 液 体，并 在 干 净 的 吸 水 纸上 拍 干。6.7 加 酶 标 记 抗 体每 孔 加 酶 标 记 抗 体 1 0 0 L，置 3 7 下 温 育 3 0 m i n，按 6.6 中 方 法 洗 板 5 次。6.8 加 底 物每 孔 加 底 物 液 A、底 物 液 B 各 5 0 L，轻 轻 振 荡 混 匀，室 温（1 8 2 5）避 光 显 色 1 0 m i n。6.9 终 止 反 应每 孔 加 终 止 液 5 0 L，轻 轻 振 荡 混 匀，1 0 m i n 内 测 定 结 果。6.1 0 测 定 吸 光 值在 酶 标 仪 上 于 6 3 0 n m 波 长 处 测 各 孔 O D 6 3 0 n m 值。D B 4 2/T 7 9 3 2 0 1 237 结 果 判 定试 验 成 立 的 条 件：阳 性 对 照 孔 O D 6 3 0 n m 值 均 0.8；阴 性 对 照 孔 O D 6 3 0 n m 值 均 0.3。如 果 S 0.3，判 为 阳 性；如 果 S 0.3，判 为 阴 性。8 注 意 事 项实 验 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 生 物 安 全 防 护 措 施，废 弃 物 应 做 无 害 化 处 理。D B 4 2/T 7 9 3 2 0 1 24A A附 录 A（规 范 性 附 录）试 剂 的 配 置A.1 洗 涤 液氯 化 钠（N a C l）8.0 g氯 化 钾（K C l）0.2 g磷 酸 氢 二 钠(N a 2 H P O 4 1 2 H 2 O)2.9 g磷 酸 二 氢 钠（N a H 2 P O 4）0.2 g吐 温-2 0（T w e e n-2 0）0.5 m L加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L置 2 8 下 保 存 备 用。A.2 样 品 稀 释 液牛 血 清 白 蛋 白（B S A）0.5 g加 洗 涤 液 至 1 0 0 m L置 2 8 下 保 存 备 用。A.3 酶 标 记 抗 体用 样 品 稀 释 液 按 1:5 0 0 0 稀 释，置 4 保 存 可 使 用 7 d。A.4 底 物 液 A 的 配 制磷 酸 氢 二 钠（N a 2 H P O 4）1 4.6 g柠 檬 酸（C 6 H 8 O 7）9.3 3 g过 氧 化 脲（C H 6 N 2 O 3）0.5 2 g加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L用 H C l 调 p H 值 至 5.0 5.4，置 2 8 下 保 存 备 用。A.5 底 物 液 B 的 配 制四 甲 基 联 苯 胺（T M B）2 0 m g无 水 乙 醇（C 2 H 6 O）1 0 m L加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L置 2 8 下 避 光 保 存 备 用。A.6 终 止 液4 0%的 氢 氟 酸(H F)6 2 5 L加 蒸 馏 水 至 1 0 0 m L置 2 8 下 保 存 备 用。A.7 包 被 液D B 4 2/T 7 9 3 2 0 1 25碳 酸 钠（N a 2 C O 3）1.5 9 g碳 酸 氢 钠(N a H C O 3)2.9 3 g加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L置 2 8 下 保 存 备 用。A.8 封 闭 液牛 血 清 白 蛋 白（B S A）0.5 g蔗 糖（C 1 2 H 2 2 O 1 1）1 g加 洗 涤 液 至 1 0 0 m L置 2 8 下 保 存 备 用。D B 4 2/T 7 9 3 2 0 1 26B B附 录 B（资 料 性 附 录）采 样 与 样 品 处 理 注 意 事 项B.1 血 样 的 采 集 和 处 理，应 进 行 无 菌 操 作，防 止 样 本 因 污 染 发 生 变 质。存 放 血 样 的 容 器 应 无 菌，可 使用 一 次 性 灭 菌 容 器。B.2 血 液 自 然 凝 固 后 无 菌 分 离 血 清 装 入 灭 菌 离 心 管 或 小 瓶 中，加 盖 密 封 后 置 2 8 下 冷 藏 保 存。每份 血 清 样 品 贴 标 签 并 写 明 编 号、采 集 地 点、免 疫 背 景、时 间 等，以 便 通 过 抗 体 检 测，做 出 追 溯 性 诊 断。B.3 采 样 及 实 验 过 中，应 穿 工 作 服、戴 口 罩 和 一 次 性 手 套。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
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