梅花鹿结核病、布鲁氏菌病综合防制规范DB22／T 1737-2012.pdf

ICS 65.020.99 B 41 备案号：36028-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1737 2012 梅花鹿结核病、布鲁氏菌病综合防制规范 Rules for integrated prevention and control in the tuberculosis and the neapolitan disease of sika deer 2012-12-21发布 2013-01-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1737 2012 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由长春市质量技术监督局提出。本标准由吉林省畜牧业管理局归口。本标准起草单位：长春市农业科学院。本标准主要起草人：田来明、杜锐、姜福子、李健明、张维珍、邹春丽、邱崇生、郝明远、张庆双、郑慧、王雨千。DB22/T 1737 2012 1 梅花鹿结核病、布鲁氏菌病综合防制规范 1 范围 本标准规定了梅花鹿的结核病、布鲁氏菌病综合防制措施。本标准适用于梅花鹿结核病、布鲁氏菌病的综合防制。2 规范性引用文件 下列 文件对 于本 文件 的 应 用 是必不可少 的。凡是注日期 的 引 用 文件，仅所注日期 的 版 本适用于本 文 件。凡是不注日期 的 引 用 文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本 文件。GB/T 18635 动物 防 疫基 本术 语 GB 16549 畜 禽产地检疫 规 范 GB 16567 种 畜 禽调运检疫 技术规 范 GB 16548病 害动物及 病 害动物产品 生 物安全处 理规 程 DB22/T 1057 梅花鹿 卫 生防 疫 技术规 范 DB/T XXXX 梅花鹿结核病、布鲁氏菌病、口 蹄疫免疫 规 程 3 术语和定义 GB/T 18635、DB/T XXXX 界 定的术 语和 定 义 适用于本 文件。4 饲养管理 4.1 调运要求 应 按照 GB 16567的要 求执行。4.2 管理规范化 4.2.1 鹿舍要求 鹿 舍实行严格消毒，保持清洁卫 生。4.2.2 人员要求 进入 鹿 舍 人 员应在严格消毒后方可进入。4.2.3 饲料及饮水要求 应 按照 DB22/T 1057的要 求执行。DB22/T 1737 2012 2 5 检疫 5.1 结核病常规检疫 5.1.1 时间 每年 春、秋两季进行检疫。5.1.2 范围 对所有 鹿 只都 要 进行一次检疫。可 春 季检半数 鹿 群，秋季检其余半数 鹿 群。5.1.3 方法 结核病 采取变态反应和酶联免疫吸附 试验(ELISA)联 合 诊断 方 法，按 附 录 A的规定 执行。5.2 布鲁氏菌病检疫 5.2.1 时间 进 场 的鹿 隔离观察 30 d，确 定 无 病 方可 混 群 饲养。5.2.2 范围 调入或调出的每一头鹿。5.2.3 方法 酶联免疫吸附 试验（ELISA），按 附 录 B的规定 执行。6 疫情报告 迅速向上级 有 关领导机关报告发 生的 疫 情，通知邻近 单位 及有 关部门 注 意预 防 工作。7 病鹿处理 7.1 结核病病鹿 发现 病鹿，应 符 合 GB16548 的规定 进行 扑杀，尸体焚烧或深埋。对 于 同 群 饲养 的 阴性 鹿 隔离 30 d后，检 测阴性 后 接 种 冻干卡介苗 归 群 饲养，同时 要 对 鹿 群 要 进行反 复 检 查。7.2 布鲁氏菌病病鹿 发现 病鹿，应 符 合 GB16548 的规定 进行 扑杀，尸体焚烧或深埋。对 于 同 群 饲养 的 阴性 鹿 隔离 30 d后，检 测阴性 鹿 接 种疫 苗 归 群 饲养，同时 要 对 鹿 群 要 进行反 复 检 查。8 免疫 梅花鹿结核病、布鲁氏菌病的 免疫应 符 合 DB22/T XXXX的规定。9 清净鹿场措施 DB22/T 1737 2012 3 9.1 引种及饲料要求 不 从 疫 区 引入动物和 购买饲料，疫 区 的畜 产品及 饲 草 饲料 要 消毒 或放置 两 个月以上才 可 利 用。9.2 日常卫生要求 严 守 防 护 制 度，穿 防 护服装并 及 时 消毒。9.3 进场人员要求 饲养 人 员和 外 来人 员及 车辆 进 场 要 进行消毒。9.4 消毒要求 食具 要 煮沸 消毒，鹿 舍地 面 和 走廊过道 用 20石 灰乳 或 2 3 火碱溶液 消毒。DB22/T 1737 2012 4 A A 附 录 A（规范性 附录）鹿结核病 变态反应（OT点眼 法）和 酶联 免疫 吸附试验（ELISA）联 合 诊断 方法 A.1.1 变态反应（OT点眼 法）A.1.2 点眼 用结核菌 素 旧牛型 结核菌 素（OT）。A.1.3 点眼 方法 采 用 一次 二回点眼 法，间 隔 3 d 5 d。A.1.4 操作程序 A.1.4.1 将 OT用 注 射 用 水 作 1:1稀释 后 使 用。A.1.4.2 在 点眼前 进行 鹿 只检 查，无 其 他 疫 病 者 方可 点眼。有 眼 病 或 失 明 者 不 宜点眼。A.1.4.3 点眼 时 一 般将 菌 素点 于 左眼，左眼 有 病 者 可 点 于 右眼，但 要 做好 标 记 和 记 录。A.1.4.4 点眼 量 为 每 头 鹿 0.2 mL 0.3 mL（约 3 5滴）。A.1.4.5 点眼 后 将 鹿 放 回原圈 舍，防 止惊 群和日 光直射。A.1.4.6 阴 雨 或 大风天 不 宜 作 点眼 检 查。A.1.5 观察判 定时间 点眼 后 3、6、9小 时 各 观察 一次。观察时 要 两 眼 对 照，注 意 眼房分泌 物 的 性 质 和数 量，眼 结 膜 和 眼 睑 有 无 肿胀，以 及是 否流泪等。A.1.6 判 定标准 A.1.6.1 阳 性 反应 在 眼角 或 眼周围 有 黄白色脓 性 分泌 物，大小 在 1 mm 10 mm（约 一 个 大米粒大）者判为阳 性；如分 泌 物不 明 显，但 有 明 显眼 结 膜充血，眼睑水肿 和 流泪者亦 可 判为阳 性。A.1.6.2 疑似反应 眼房分泌 物 呈灰白色 半 透 明，大小 在 1 mm 10 mm（约 一 个 大米粒大），但 无 明 显眼睑水肿判为疑 似。A.1.6.3 阴 性 反应 无 任何 反应 或 稍 有 眼睑水肿 及 浆液 性 眼房分泌者判为 阴性。A.1.6.4 两回点眼 综合 判 定 DB22/T 1737 2012 5 对 第 一 回点眼呈 阴性或 疑似 反应 的鹿，隔 3 5天 在 同 一 眼、同 样 量 进行 第二回点眼。两 回均为 阴性者判为 阴性；两 回均为疑似者判为阳 性；第 一 回疑似，第二回 阴性 者判为 阴性；第 一 回 阴性，第二回疑 似者，隔 一 个月 后 再 进行一次检疫。根据 反应 酌 定。A.1.6.5 点眼适宜 时间 A.1.6.5.1 春 季 3月 4月，秋季 8月 10月 为点眼 最 佳 时 间。A.1.6.5.2 公 鹿 可 结合 锯 茸 进行 点眼，母 鹿 可 结合 仔 鹿 断 奶 分 群进行 点眼。A.2 酶联 免疫 吸附试验（ELISA）A.2.1 抗原 牛型 结核菌 素 提 纯蛋 白 衍 生 物（PPD）。A.2.2 第二抗体 用鹿 IgG免疫 制 备 的 兔抗 鹿 IgG，即成 为 HRP-IgG。A.2.3 操作程序 A.2.3.1 抗原包被 每 孔加抗 原（20 g/mL）0.1 mL。每 板设抗 原、抗 体、酶 结核 物和 空 白 对 照。放 37 湿盒孵育 3 h。取 出用 洗 液 洗涤 3次，每次 3分 钟。A.2.3.2 加被 检 血 清 每 孔待 检 血 清（1:100）0.1 ml，每 份 血 清 加 两 孔，并 每 板设 标 阳、标 阴 血 清对 照，放 37 湿盒孵 育 1 h。取 出 洗 液 洗涤 3次，每次 3分 钟。A.2.3.3 加酶 结合 物 每 孔加 酶 结合 物（浓 度试验 前 标定）0.1 mL，放 37 湿盒孵育 1 h。取 出用 洗 液 洗涤 3次，每次 3分 钟。A.2.3.4 加底物（过氧 化 氢邻苯二胺）以过 氧化氢 邻 苯 二 胺 为 底 物 液，每 孔加 0.1 mL，放 37 湿盒孵育 15 min，取 出 后 终 止 反应。A.2.3.5 终止反应 用 2 M H2SO4作 为 终 止液，每 孔加 0.05 mL，终 止 其反应。A.2.4 检 测 用 酶联免疫 测 定 仪 检 测，放 490 nm处，以 空 白 调 零，测 定 各 孔 OD值。A.2.5 判 定标准 以 P/N 2为判 定标准。确 定 其 判 定 临 界 OD值 为 0.56。凡 OD值 等 于 或 大 于 0.56者为阳 性。DB22/T 1737 2012 6 A.3 变态反应（OT点眼 法）和 酶联 免疫 吸附试验（ELISA）联 合检疫 判 定 A.3.1 首先 对 被 检疫 鹿 群进行 结核菌 素 一次 二回点眼。结核菌 素阳 性 者判为 结核病 阳 性 鹿。对 结核菌素 阴性 者 和可 疑者，暂 不 作 判 定。A.3.2 将 结核菌 素 阴性 鹿 采 血 进行 ELISA检 查，ELISA阳 性 者判为 结核病 阳 性 鹿，ELISA阴性 者判为 结核病 阴性 鹿（即 点眼 和 ELISA双 阴性 鹿）。A.3.3 对 结核菌 素点眼 可 疑 反应 鹿 采 血 进行 ELISA检 测。ELISA阳 性 判为 结核病 阳 性 鹿；ELISA阴性 者判为 结核病 阴性 鹿。DB22/T 1737 2012 7 B B 附 录 B（规范性 附录）鹿布鲁氏菌病 酶联 免疫 吸附试验(ELISA)诊断 方法 B.1 抗原 用 灭 菌 蒸馏 水稀释 布氏 杆 菌 猪 二 号 苗，并 制 成 100 亿/毫升 菌 液，经 反 复冻 融 后，置 超声波破碎器中 15 min，离 心去沉淀，其 上 清 液再 用 蒸馏 水透 析，浓缩至蛋 白 含 量 为 3.0 g/mL。B.2 第二抗体 用鹿 IgG免疫 制 备 的 兔抗 鹿 IgG，用 辣 根 过 氧化 物酶（HRP）标定，成 为 HRP-IgG。B.3 操作程序 B.3.1 抗原包被 将 超抗抗 原 用 包 被 液 1:25倍 稀释 后，每 孔加 0.1 mL，同时 设抗 原、酶 结合 物和 空 白 对 照，置 37 温箱孵育 3 h。B.3.2 洗涤 取 出 反应 板，甩去微孔中 的 抗 原溶液，用 pH 7.4 0.01M的 PBST加 入 各 孔，室温 下 放置 3 min后 倒掉，如 此 反 复 三 次。B.3.3 加被 检 血 清 将 被 检 血 清 按 1:100倍 稀释，每 孔加 0.1 mL，每 份 血 清 加 两 孔，并 设 阳 性 血 清和 阴性 血 清对 照，置 37 温箱中 0.5 h后，取 出 反应 板，甩去微孔中 的 血 清。用 pH 7.4 0.01M的 PBST加 入 各 孔，室温 下 放置3 min后 倒掉，如 此 反 复 三 次。B.3.4 加酶 结合 物 将 酶 结合 物 按 1:3200倍 稀释，每 孔加 0.1 mL，置 37 温箱中 0.5 h后，取 出 反应 板，甩去 酶 结合 物。用 pH 7.4 0.01M的 PBST加 入 各 孔，室温 下 放置 3 min后 倒掉，如 此 反 复 三 次。B.3.5 加底物液（过氧 化 氢邻苯二胺）每 孔加 0.1 mL，置 37 温箱中 0.5 h。B.3.6 终止反应 取 出 反应 板（不 甩掉 原液，不 洗涤）每 孔加 0.05 mL的 2M H2SO4，以 终 止 反应。B.3.7 检 测 DB22/T 1737 2012 8 静 止 5 min，将 反应 板 放 酶联免疫检 测 仪 上，在 490 nm处 空 白 调 零，并测 每 孔 的 OD值。将 OD值 0.32定 为阳 性 判 定标准。_