大豆孢囊线虫病抗性室内鉴定方法DB23／T 2476—2019.pdf

ICS 6 5.0 2 0.2 0B 1 6DB23黑 龙 江 省 地 方 标 准D B 2 3/T 2 4 7 6 2 0 1 9大 豆 孢 囊 线 虫 病 抗 性 室 内 鉴 定 方 法2 0 1 9-1 1-2 0 发 布2 0 1 9-1 2-1 9 实 施黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 2 3/T 2 4 7 6 2 0 1 9I前 言本 标 准 依 据 G B/T 1.1 2 0 0 9 的 编 写 规 则 起 草。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 农 村 厅 提 出。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 标 准 化 技 术 委 员 会 归 口。本 标 准 起 草 单 位：中 国 科 学 院 东 北 地 理 与 农 业 生 态 研 究 所 农 业 技 术 中 心、哈 尔 滨 瑞 康 源 生 物 科 技 有限 公 司、黑 龙 江 省 绿 色 食 品 科 学 研 究 院。本 标 准 主 要 起 草 人：李 春 杰、王 从 丽、尤 佳、胡 岩 峰、王 英 男、潘 凤 娟、黄 铭 慧、姜 野。D B 2 3/T 2 4 7 6 2 0 1 92大 豆 孢 囊 线 虫 病 抗 性 室 内 鉴 定 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 大 豆 孢 囊 线 虫 病 抗 性 室 内 鉴 定 方 法 中 的 试 剂、材 料 和 仪 器 设 备、空 气 环 境 与 培 养 条 件、鉴 定 材 料、育 苗 与 移 苗、培 养、线 虫 接 种 液 制 备、接 种、调 查、抗 性 评 价 方 法。本 标 准 适 用 于 对 大 豆 孢 囊 线 虫 不 同 生 理 小 种 的 抗 性 鉴 定。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的。凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。G B 3 0 9 5 环 境 空 气 质 量 标 准G B 4 4 0 4.2 粮 食 作 物 种 子 第 2 部 分：豆 类N Y/T 3 0 5 9 大 豆 抗 孢 囊 线 虫 鉴 定 技 术 规 程3 试 剂、材 料 和 仪 器 设 备3.1 试 剂霍 格 兰 氏（H o a g l a n d）营 养 液：硝 酸 钙 9 4 5 m g/L、硝 酸 钾 6 0 7 m g/L、磷 酸 铵 1 1 5 m g/L、硫 酸 镁4 9 3 m g/L、铁 盐 溶 液 2.5 m L/L、微 量 元 素 5 m L/L、p H 6.0，无 菌 水 1 L，使 用 时 稀 释 2 0 倍。铁 盐 溶 液：七 水 硫 酸 亚 铁 2.7 8 g、乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠（E D T A.N a）3.7 3 g、无 菌 蒸 馏 水5 0 0 m L、p H 5.5。微 量 元 素 液：碘 化 钾 0.8 3 m g/L、硼 酸 6.2 m g/L、硫 酸 锰 2 2.3 m g/L、硫 酸 锌 8.6 m g/L、钼 酸 钠 0.2 5 m g/L、硫 酸 铜 0.0 2 5 m g/L、氯 化 钴 0.0 2 5 m g/L。3.2 材 料（a）植 物 生 长 袋（长 1 7.8 c m，宽 1 6.5 c m）、（b）快 捞 夹（长 2 9.8 c m，宽 2 3.3 c m）、（c）快 捞架（长 3 9.5 c m，宽 3 2.5 c m）、（d）蛭 石（2 0 目）、（e）培 养 钵（高 1 1.5 c m，直 径 2 0 c m）。3.3 仪 器 设 备（a）孢 囊 分 离 筛（2 0 目、1 0 0 目、2 0 0 目、5 0 0 目）、（b）移 液 器（5 m L）、（c）线 虫 孵 化 池、（d）线 虫 计 数 板、（e）光 学 显 微 镜（4 4 0）、（f）恒 温 光 照 培 养 箱、（g）高 压 蒸 汽 灭 菌 器（1 2 1、3 0 m i n）。4 室 内 空 气 环 境 与 培 养 条 件4.1 室 内 空 气 环 境室 内 空 气 环 境 质 量 要 求 符 合 G B 3 0 9 5 的 规 定。4.2 培 养 条 件D B 2 3/T 2 4 7 6 2 0 1 93培 养 箱 调 至 光 周 期 为 1 6 h 光 照、8 h 黑 暗、白 天 温 度 2 8、夜 间 温 度 2 2、相 对 湿 度 7 0%的 循 环 程序。5 鉴 定 材 料鉴 定 材 料 种 子 质 量 应 符 合 G B 4 4 0 4.2 的 规 定。6 育 苗 与 移 苗6.1 育 苗将 待 鉴 定 的 种 子 播 种 在 装 有 无 菌 蛭 石 的 培 养 钵 中，每 钵 4 0 粒，常 规 管 理。3 d 后 种 子 萌 发 出 幼 苗，剔 除 生 长 不 良 的 植 株，保 留 生 长 一 致 的 3 0 株 幼 苗 备 用。6.2 移 苗（a）浸 湿 生 长 袋。向 直 立 的 生 长 袋 内 滤 纸 顶 端 夹 缝 内 加 入 无 菌 水 1 0 m L，使 生 长 袋 中 的 滤 纸 充 分 浸湿 且 生 长 袋 底 部 有 少 量 无 菌 水 存 留。（b）移 苗。将 3 0 株 备 用 幼 苗 转 移 到 浸 湿 的 滤 纸 顶 端 夹 缝 内，保 持 子 叶 高 于 生 长 袋 上 沿，每 个 生 长袋 内 移 入 1 株 幼 苗。（c）摆 放。每 2 个 生 长 袋 放 入 1 个 快 捞 夹 中，将 快 捞 夹 放 到 快 捞 架 上，每 个 快 捞 架 上 放 置 3 0 个 快捞 夹。7 培 养将 整 个 快 捞 架 置 于 培 养 箱 中，每 三 天 浇 5 m L 霍 格 兰 氏 营 养 液 和 5 m L 无 菌 水。8 线 虫 接 种 液 制 备8.1 扩 繁 线 虫经 单 孢 囊 纯 化 的 孢 囊 群 体 接 种 在 感 病 品 种 根 部 土 壤 中 培 养 3 5 d。8.2 收 集 孢 囊收 集 感 病 品 种 根 部 及 土 壤 中 的 孢 囊：将 感 病 品 种 根 和 根 部 土 壤 放 入 盛 有 1/3 清 水 的 1 L 烧 杯 中，用玻 璃 棒 将 泥 水 混 合 物 剧 烈 搅 拌，静 置 1 m i n 左 右，将 上 清 液 依 次 倒 入 2 0 目 和 1 0 0 目 的 孢 囊 分 离 筛 中。用高 压 水 枪 冲 洗 2 0 目 筛 子 上 的 感 病 品 种 根、土 壤 及 残 留 物，将 落 入 1 0 0 目 筛 子 上 的 孢 囊 冲 洗 至 烧 杯 中，用 置 于 漏 斗 架 上 的 单 层 滤 纸（直 径 为 1 2.5 c m）过 滤。用 毛 笔 轻 轻 地 刷 分 布 于 滤 纸 边 缘 的 孢 囊，收 集 后即 得 到 大 量 孢 囊。8.3 分 离 线 虫 卵将 收 集 的 孢 囊 转 移 到 2 0 0 目 筛 子 上，下 面 套 5 0 0 目 筛 子。用 橡 皮 塞 在 2 0 0 目 筛 子 上 碾 磨 孢 囊 使 卵 释放 出 来，高 压 水 枪 冲 洗，收 集 落 于 5 0 0 目 筛 子 上 的 卵。8.4 线 虫 卵 孵 化将 线 虫 卵 悬 液 加 入 线 虫 孵 化 池 内，置 于 恒 温 培 养 箱（2 8，黑 暗）内 孵 化 4 5 d，收 集 孵 化 出 来 的二 龄 幼 虫 悬 浮 液。D B 2 3/T 2 4 7 6 2 0 1 948.5 二 龄 幼 虫 接 种 液 制 备将 二 龄 幼 虫 悬 浮 液 注 入 线 虫 计 数 板，于 光 学 显 微 镜 下 调 查 二 龄 幼 虫 浓 度，不 断 稀 释 使 线 虫 浓 度 调 至1 7 0 条/m L，并 作 为 接 种 液，备 用。大 豆 孢 囊 线 虫 不 同 生 理 小 种 二 龄 幼 虫 接 种 液 制 备 方 法 相 同。9 接 种待 测 植 株 侧 根 生 长 至 5 c m 左 右（约 5 7 d），从 快 捞 夹 中 取 出 生 长 袋，用 移 液 器 向 主 根 和 侧 根 及 其周 围 均 匀 滴 加 3 m L 孢 囊 线 虫 二 龄 幼 虫 悬 浮 液，将 接 种 后 的 生 长 袋 水 平 放 置 在 培 养 箱 中，2 4 h 后 将 生 长 袋垂 直 放 在 快 捞 架 上，置 培 养 箱 中 继 续 培 养。每 个 品 种 接 种 3 0 株，每 1 0 株 为 一 个 重 复。1 0 调 查培 养 至 2 1 d 后 将 生 长 袋 内 的 滤 纸 连 同 整 个 根 系 取 出，调 查 每 株 根 系 孢 囊 数 量。1 1 抗 性 评 价 方 法抗 性 评 价 方 法 应 按 N Y/T 3 0 5 9 执 行，孢 囊 指 数 按 照（A.1）计 算，对 大 豆 孢 囊 线 虫 病 抗 性 评 价 标 准 见表 1，鉴 定 调 查 表 参 见 附 录 表 A.1。100 CTFI(A.1)F I-孢 囊 指 数；T-待 鉴 定 材 料 单 株 根 系 平 均 孢 囊 数；C-感 病 对 照 单 株 根 系 平 均 孢 囊 数。表 1 对 大 豆 孢 囊 线 虫 病 抗 性 评 价 标 准孢囊 指数（IP）抗性0 9%抗（R）1 0%3 0%中抗（M R）3 1%6 0%中感（M S）6 0%感（S）D B 2 3/T 2 4 7 6 2 0 1 95附 录 A（规 范 性 附 录）表 A.1 对 大 豆 孢 囊 线 虫 病 抗 性 鉴 定 调 查 表日 期：编号 材料 名称孢囊 数量/株孢囊指数(IP)抗性1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 平均1234567891 01 11 21 31 41 51 61 71 81 92 02 12 22 32 42 52 62 72 82 93 0鉴 定 技 术 负 责 人（签 字）：