番茄苗期抗黄化曲叶病毒基因快速检测技术规程DB13／T 2456-2017.pdf

ICS 67.080.01 B 31 DB13 河北省地方标准 DB13/T 2456 2017 番茄苗期 抗黄化曲 叶病 毒基因快 速检测技 术规程 2017-03-29 发布 2017-06-01 实施 河 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB13/T 2456 2017 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由河 北省 农林 科学 院提出。本标准 起草 单位：河 北省 农林科 学院 经济 作物 研究 所。本标准 主要 起草 人：吴志 明、李 亚栋、耿 保进、高 慧敏、田玉、孙 英焘、孙 世卫、寇慧 苹、冯 贺敬。DB13/T 2456 2017 1 番茄苗 期 抗黄化 曲叶病毒 基因快速 检测技 术规程 1 范围 本标准 规定 了 番 茄苗 期抗 黄化曲 叶病 毒基因 的 检测 前准备 和检 测技 术。本标准 适用 于 番 茄苗 期抗 黄化曲 叶病 毒基因Ty-1、Ty-2、Ty-3/3a 的 分子 快速 检测。2 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。2.1 番茄黄 化曲 叶病 毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease）为病毒 性病 害，病原 为番 茄黄化 曲叶 病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV or TY），病原 特 征及 发病 症状 见附 录C。2.2 番茄抗 黄化 曲叶 病毒 基因 2.2.1 番茄抗 黄化 曲叶 病毒 基因Ty-1 定位在 番茄 第6 号染 色体 上(基因 号)。2.2.2 番茄抗 黄化 曲叶 病毒 基因Ty-2 定位在 番茄 第11 号染 色体 上。2.2.3 番茄抗 黄化 曲叶 病毒 基因Ty-3/3a 定位在 番茄 第6 号染 色体 上。3 检测前 准备 3.1 检测仪器 组织研 磨仪、恒 温水浴 锅、离心机、高 压灭 菌锅、移液 器、称 量天 平、冰 箱(4、-20、-80)、电泳仪、紫 外凝 胶成 像仪、PCR 仪等。3.2 检测试剂 DNA提 取液(CTAB)、氯仿/异戊醇(24/1)、乙醇、异 丙醇、蒸馏 水、双蒸 馏水（ddH2O）、TE 缓冲 液(Ph=8.0)、50 x TAE 缓冲 液、Goldview、DM2000、琼脂糖、Taq 酶 等。3.3 检测引 物 DB13/T 2456 2017 2 表1给 出了 抗TYLCV 的 抗病 基因扩 增引 物。表1 Ty-1、Ty-2 和 Ty-3/3a 检测 引物 基因 染色体 引物 序列(5-3)扩增产物(bp)标记类型 Ty-1 6 Ty1 正向 TGTATGCGTCGTGTTAGAAGGTC 984（抗）1434（感）SNP Ty1 反向 AATGGTGACAGAATCAAGATCCAC Ty1-3 AAACGCTCTTCTTCCCCTCG Ty1-4 AGTTAGATTCAGGCTCCTCGCA Ty-2 11 Ty2 正向 AAAATGTTCGTCTCTTTTAATCATAC 194（抗）494（感）SCAR Ty2 反向 AGTGTACATCCTTGCCATTGACT Ty-3/3a 6 Ty3 正向 GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC Ty3 450（抗）320（感）SCAR Ty3 反向 GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC Ty3a630（抗）3.4 DNA 提取 液 配制 配制以下DNA提取 液：a)100 mmol/L Tris(pH=8.0)；b)50 mmol/L EDTA；c)500 mmol/L NaCl；d)2%CTAB（W/V）；e)0.8%皂土（W/V）。4 检测技 术 4.1 样品采 集和 保存 采集定 植前 番茄 苗至 少3 个 样本，每个 样本 随机 选取3 5株，进行 编号、保存。短期保 存温度4，长期 保存温度-20 或-80。4.2 DNA 提取 DNA提取 按 下列 步骤 进行：a)在2 mL 离 心管 加入 0.2 g 左右样 本、一粒 磨样 珠，用磨样 机研 磨成 匀浆；b)加入600 l 65 预热 的DNA 提 取液，65 保温 30 min 以上；c)加入600 l 氯仿/异戊 醇（24/1），上下 颠倒 混匀 数次，室温 静 置 5 min；d)6000 rpm 以上 室 温离 心 10 min，吸 取上 清 液400 L 至 1.5 ml 离心 管中，加入 等体积 的异 丙醇，上 下颠 倒混 匀，室 温 静置5 min；e)10000 rpm 以上 离心10 min，弃 上清 液；f)加入1 ml 70%乙醇 洗涤，用手指 轻弹 使沉 淀漂 浮于 乙醇中；g)6000 rpm 以上 离心5 min，弃上 清 液，将 离心 管倒 扣在滤 纸上，风 干 DNA；h)加入 50 L TE 缓冲 液；DB13/T 2456 2017 3 i)完全溶 解后，取 4 L DNA 进行 1%的 琼脂 糖凝 胶电 泳分析，剩 下的 置于-20 或-80 冰箱中保存。4.3 Ty-1、Ty-2 和 Ty-3/3a 检测 4.3.1 PCR 检 测反 应体 系 PCR反 应液 体积 为20 L，组分配 制应 符合 表2 的规 定。表2 PCR 反应 体系 反应组分 原浓度 终浓度 反应体积 L DNA 30 ng/L 50 ng/L 1.5 ng/L 2.5 ng/L 1 1 0 b u f f e r 10buffer 1buffer 2 dNTP 2.5 mmol/L 0.15 mmol/L 1.6 Taq 酶 5 U/L 0.2U/L 0.2 正向引物 10 mol/L 0.5 mol/L 1 反向引物 10 mol/L 0.5 mol/L 1 ddH2O-13.2 4.3.2 Ty-1、Ty-2 和 Ty-3/3a PCR 反应 程序 按下列 程序 进行 操作：a)94 预 变性5 min；b)94 变性50 s，58 退火30 s，72 延伸1 min30 s，共5 个循 环；c)94 变性50 s，56 退火30 s，72 延伸1 min 30 s，共30 个 循环；d)72 延伸10 min，4 保存。4.3.3 电泳检 测 采用1.5%（w/v）琼 脂糖 凝胶电 泳进 行检 测。用紫 外凝胶 成像 仪 记 录电 泳结果。5 检测 结 论与 检测 报告 5.1 检测结 论判 定依 据检 测结 果 进行，检测 结 果显 示为 电泳图 谱。电泳 图谱 见附 录A。5.2 填写 检 测报 告，检测 报告 式样见 附 录B。DB13/T 2456 2017 4 附 录 A（规范 性附 录）电 泳图 谱 注：Ty-1 纯合体显示984 bp 条带，感病纯合体显示 1343 bp 条带，而杂合体显示 984 bp 和1343 bp 条带。图A.1 Ty-1 抗 病基 因检测 电泳 图谱 注：Ty-2 纯合体显示194 bp 条带，感病纯合体显示 494 bp 条带，而杂合体显示 194 bp 和494 bp 条带。图A.2 Ty-2 抗 病基 因检 测 电泳图 谱 注：Ty-3 a 纯合体显示630 bp 条带，Ty-3 纯合体显示450 bp 条带，感病纯合体显示 320 bp 条带，而Ty-3/Ty3a的杂合体分别 显示 630/450 bp 和 320 bp 条带。图A.3 Ty3/Ty3a 抗 病基 因 电泳图谱 DB13/T 2456 2017 5 附 录 B（规范 性附 录）检测报告 式样 表B.1 检测 报告 式样 番茄苗期抗黄化曲叶病毒 基因快速检测报告 共 页，第 页（附图 页）样品名称：样品编号：样品数量：样品性状：检验项目：检验依据：主要仪器设备：检验条件：检验时间：送检单位：送样时间：联系地址：联系电话：检验内容及结果：1、受检样品性状 2、检验方法 3、结果 4、结论 承检单位：地址：邮政编码：联系人：联系电话：主检人：技 术 负 责 人：检验日期：年 月 日 DB13/T 2456 2017 6 附 录 C（资 料性 附录）番茄 黄化 曲叶 病病原 特 征 及发病 表现 中 国 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)，属 于 双 生 病 毒 科（Geminiviridae），菜 豆 金色花 叶病 毒属（Begomovirus）病毒，因 该属 病毒 在自然 条件 下只 能由 烟粉虱（Bemisia tabaci）以持久 方式 传播，又 被称 为粉虱 传双 生病 毒，是一 类具有 孪生 颗粒 形态 的 植物DNA 病毒 植株矮 化，生长 缓慢 或停 滞，顶 部叶 片常 稍褪 绿发 黄、变 小，叶片 边缘 上卷，叶片 增厚，叶 质 变硬，叶 背面 叶脉 常显 紫色。生长 发育 早期 染病 植株 严重矮 缩，无法 正常 开花 结果；生长 发育 后期 染 病植株仅 上部 叶和 新芽 表现 症状，结果 数减 少，果实 变小，成熟 期果 实着 色不 均匀(红不 透)，基本 失 去商品价值。_