金针菇液体菌种生产技术规程DB37／T 3747-2019.pdf

ICS 65.020.20 B 05 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3747 2019 金针菇液 体菌种生 产技术规 程 Technical progress of liquid spawn culture by Flammulina velutiper 2019-12-05 发布 2020-01-05 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 3747 2019 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由山 东省 农业 农村 厅提出 并组 织实 施。本标准 由山 东省 农业 标准 化技术 委员 会归 口。本标准 起草 单位：山 东农 业工程 学院、山 东省 农业 技术推 广总 站、山东 益生 园菌业 有限 公司、齐 鲁师范学 院、济宁 市蔬 菜工 作指导 站、金乡 食用 菌管 理办公 室、山东 常生 源菌 业有限 公司、济 宁 利 马 菌 业有限公 司。本标准 主要 起草 人：牛贞 福、国 淑梅、于 安军、徐 金强、曹健、颜 亚男、崔 艳秋、周爱 国、常 猛、张广龙。DB37/T 3747 2019 1 金 针菇液 体菌种生 产技术 规程 1 范围 本标准 规定 了金 针菇（Flammulina velutiper）液 体 菌种生 产环 境、厂房 设施、生产 设备、品 种、工艺流 程及 贮藏 等技 术要 求。本标准 适用 于金 针菇 液体 菌种的 生产。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB 150 钢 制压 力容 器 GB 5749 生活 饮用 水卫 生 标准 GB 50073 洁净 厂房 设计 规范 NY/T 528 食用 菌菌 种生 产技术 规程 NY/T 1284 食 用菌 菌种 中 杂菌及 害虫 的检 验 NY 5099 无公 害食 品 食 用菌栽 培基 质安 全技 术要 求 3 术语和 定义 GB/T 12728 界定 的以 及下 列术语 和定 义适 用于 本文 件。3.1 液体菌 种 liquid spawn 液体菌 种是 指在 装有 液体 培养基 的容 器中，通过 控 制温度、不断 通气 搅拌 或 振荡，使 菌丝 短期 内在液体中 繁育 并获 得的 大量 菌丝体 片段 或菌 丝球。3.2 食用菌 液体 菌种 培养 器 cultivation apparatus for edible fungus liquid spawn 也称液 体菌 种培 养罐，是 指 进行食 用菌 液体 菌种 培养 的专用 设备，包 括固 定式 和 可移动 式两 种类 型。要求不 锈钢 材质，符 合GB 150 钢 制压 力容 器标 准。3.3 食用菌 液体 菌种 接种 器 edible fungus-liquid interface trap inoculators 指能将 液体 菌种 从培 养器 中按无 菌操 作要 求转 接到 食用菌 固体 培养 基物 料上 的设备。4 技术要 求 DB37/T 3747 2019 2 4.1 技术人 员 具有食 用菌 菌种 生产 或检 验人员 从业 资格 证的 专业 技术人 员。4.2 生产环 境 4.2.1 基本要 求 空气 优 良、地 势高 燥、交 通方便、通风 良好、水源 电源充 足、排 水畅 通，其 中水源 应符合GB 5749的规定。4.2.2 环境卫 生要 求 金针菇 液体菌 种生 产场所 应距工 矿业的“三 废”及 微生物、烟尘 和粉 尘等污 染源500 m 以 上。生 产场所有 硬质 路面、排 水良 好的道 路。4.2.3 液体菌 种生 产场 所 液体菌 种生 产场 所地 面应 能防水、防 腐蚀、防 渗漏、防滑，易 清洗，应 有1.0 1.5 的排 水坡 度和良好 的排 水系 统，排水 沟应是 圆弧 式的 明沟。墙 壁和天 花板 应能 防潮、防 霉、防 水、易清 洗。4.2.4 液体菌 种接 种间 液体菌 种接 种间 应设 置缓 冲间和 风淋 消毒 间，缓 冲 间入口 处设 置洗 手、消 毒 和干手 设施，设置 与接种职工 人数 相适 应的 更衣 室。接种 车间 设封 闭式 废 物桶，安 装排 气管 道或 者 排风设 备，门 窗应 设置 防 蚊蝇纱网。5 生产设 施设 备 5.1 生产设 施 原料库、配 料间、发 菌间、冷却 间、接种 间、培养 室、检 测室 规模 要配 套，布局合 理，要有 调 温 设施，设 计符 合GB 50073 要 求。5.2 生产设 备 液体菌 种培 养器、液 体菌 种接种 器、高压 蒸汽 灭菌 锅、蒸 汽锅 炉、超 净工 作 台、恒 温摇 床、恒 温培养箱、冰箱、普 通光 学显 微镜、磁力 搅拌 机、磅秤、天平、酸 度计 等。其中 液体菌 种培 养器、高 压 灭 菌锅和蒸 汽锅 炉应 使用 经政 府有关 部门 检验 合格，符 合国家 压力 容器 标准 的产 品。6 培养基 质 应符合NY 5099 的规 定。7 生产品 种 选用高 产、优质、抗 逆性 强、商品 性好 的金 针菇 品种，从具相 应资 质的 供种 单位 引种或 本单 位选 育，并清楚 地追 溯菌 种来 源。菌种生 产过 程应 符合NY/T 528 的 要求。DB37/T 3747 2019 3 8 液体菌 种生 产 8.1 液体菌 种生 产工 艺流 程 金针菇 液体 菌种 生产 工艺 流程见 图1。图1 金针菇 液体 菌种 生产 工艺 流程图 8.2 液体菌 种培 养器 维护 8.2.1 检查 检查培 养器 上全 部阀 门、安全阀、压 力表，要 求完 好、正 常。8.2.2 清洗 对罐内、外 和全 部阀 门用 流水冲 洗，达到 无死 角、内壁无 任何 残留 物。8.2.3 煮罐和 空消 培养器 初次 使用、出 现杂 菌、长 期放 置、更换 品种 时，都 要求 煮罐 和空 消进 行灭菌。煮 罐和 空 消 要求蒸气 压力0.12 MPa、温 度121、灭菌40 min。8.3 液体菌 种培 养基 配方 金针菇 液体 菌种 生产 推荐 选用配 方：a)配方一：黄 豆粉 10 g/L、蔗糖3.0 g/L、KH2P04 1 g/L、MgS04 0.5 g/L。b)配方二：玉 米 粉6 g/L、黄豆 粉4.5 g/L。c)配方三：玉 米 粉 1.0 g/L，黄豆 粉 1.5 g/L，葡萄 糖 7.5 g/L，酵 母膏 1.5 g/L，磷酸 二 氢 钾0.5 g/L，硫酸 镁 0.25 g/L。其中黄 豆粉、玉 米粉 均过100 目筛，筛 孔直 径0.15 mm。8.4 投料和 定容 首先用 温水 把玉 米粉、黄 豆 粉和配 方中 其他 成分 搅拌 均匀，不能 有结 块，通过 吸 管或漏 斗加 入罐 体，液体量 在罐 体容 量的70%80%为宜。然 后加 入0.03%消 泡剂，最 后拧 紧上 料 口盖。8.5 液体培 养基 灭菌 8.5.1 气动搅 拌 调整控 温箱 温度 至125，打开 罐体 加热 棒开 始对 罐体进 行加 热，在100 之前一 直开 启罐 体 夹 层出水阀，以放 掉夹 层里的 虚压和 多余的 水。温度在70 以 下时打 开空 气压缩 机通过 其储气 罐和 空气 过滤器对 罐体 培养 基进 行气 动搅拌，防 止液 体结 块。DB37/T 3747 2019 4 8.5.2 灭菌 当罐体 内培养 基达70 时，关闭 气泵。当夹 层出水 阀出热 蒸汽3 min 5 min 后关闭。当罐 体压 力表达到0.12 MPa 开始 计时，保持30 min 40 min，保持压 力期 间以 温调 压。8.5.3 降温、放夹 层热 水 调整控 温箱温 度至25，关闭加 热棒、罐底 进气阀、空气 过滤器 夹层 出气阀。用燃 烧的酒 精棉 球烧空气 过滤 器出 气阀40 s 50 s，在 此期 间可 小开5 s 6 s空 气过 滤器 出气 阀，放蒸 汽。在酒 精棉 球火焰的保 护下 把主 管接 回空 气过滤 器出 气阀。打 开空 气过滤 器出 气阀 和空 气过 滤器进 气阀，小 开 罐 体 放 气阀，通 过夹 层进 水阀 把夹 层热水 放掉，直 至夹 层压 力表压 力 为0。8.5.4 冷却 打开夹 层放 水阀，夹 层进 水阀通 过硅 胶软 管接 入水 管，进行 冷却。当 罐体 压 力表压 力降 至0.05 MPa时，打开 气泵 以防 止罐 体 在冷却 过程 中产 生负 压造 成污染，并使 下部 冷水 向 上冷却 较快。通过 罐体 放 气阀调节 罐体 压力 在0 以上 直 至罐体 温度 降至28，等 待接种。8.6 菌种制 作 8.6.1 固体专 用种 生产 8.6.1.1 固体专 用种 的制 作 金针菇 液体菌 种的 固体专 用种培 养基配 方（200 L）：过40 目筛的 阔叶 木屑500 g、麸 皮100 g、石膏10 g，料水 比1:1.2。原 料混合 均匀后 装入500 mL 三角瓶 内，高 压灭 菌后接 入金针 菇母种，洁 净环 境培养至 菌丝 长满 培养 基。金针菇 母种 制作、高 压灭 菌、接 种、发 菌应 符合NY/T 528 的规 定。接 种前 应将培养好 的固 体专 用种 取样 镜检或 培养 观察 确定 无杂 菌后再 做菌 种使 用。8.6.1.2 无菌水 的制 作 1 000 mL 的 三角 瓶加 入500 mL 600 mL 的 自来 水，用 手提式 高压 灭菌 锅在121、0.12 MPa 条 件下保持30 min 即可 制备 无菌 水。8.6.1.3 固体专 用种 并瓶 将固体 专用 种的 三角 瓶壁 用75%酒精 棉球 均匀 擦拭 消毒后，连同 接种 工具、无菌水 放入 接种 箱或 超净工作 台中 进行 消毒，消 毒20 min 后 进行 接种。用75%酒 精棉 球擦 手，用酒 精 灯火 焰 对接 种工 具进 行灼烧灭菌。用 灭菌 后的 接种 工具在 酒精 灯火 焰下 去掉 三角瓶 固体 专用 种的 表层 部分。把菌 种中 下 部 分 搅 碎后在酒 精灯 火焰 保护 下分3 4次 加入 无菌 水中，然 后 用手腕 摇动 三角 瓶使 菌种 和无菌 水充 分接 触，静置10 min 后接 入罐 体。8.6.2 摇瓶菌 种生 产 8.6.2.1 容器 使用无 色或 近无 色三 角瓶，可用 棉塞（梳 棉或 化纤 棉）、硅胶 塞、专用 封口 透气膜 封口。8.6.2.2 培养基 配方 以配制1 000 mL 培 养基 计，马铃 薯200 g（煮汁）、葡萄糖20 g、蛋 白胨20 g、酵母 粉2 g、磷 酸二氢钾1 g、硫酸 镁0.5 g，pH 自然。DB37/T 3747 2019 5 8.6.2.3 培养基 配制 选无青 皮、未发 芽的 新鲜 马铃薯 洗净、去 皮、去芽 眼，切成2 cm 大 小的 块状，加水煮 沸，文火 维 持30 min，用 预湿的4 层纱 布 过滤。再加入 其余 的原料 至溶解，定容。培 养基分 装到摇 瓶中，装液 量为 摇瓶容量 的2/5 3/5，在摇 瓶中放 一粒 转子，瓶 塞封 口，并 用硫 酸纸 或牛 皮纸 包扎。8.6.2.4 灭菌 将分装 好的 摇瓶 放入 高压 蒸汽灭 菌锅 内进 行灭 菌，压力升 到0.05 MPa 时，打 开放气 阀排 除冷 空 气，如此重 复一 次。压力 升至0.12 MPa、温度121 时，维持30 min 40 min。8.6.2.5 接种培 养 待培养 基冷 却后 置于 消过 毒的净 化工 作台 上，用 经 火焰消 毒并 冷却 后的 接种 针挑取56 块 3 mm 5 mm3 mm 5 mm 的 母种块 迅速转 接于待 接种 摇瓶培 养基内。接种 结束 后封口，放入25 恒温 箱中 静 置培养1 d，然 后 置 于 磁 力 搅 拌 器 或 恒 温 摇 床 上 培 养，温 度 控 制 在25 28，转速140 r/min 160 r/min，培 养时 间6 d 7 d。8.7 菌种接 入罐 体 用带有 手柄 的内 径略 大于 接种口 的铁 丝圈 缠绕 纱布，蘸 上95%酒精，制 成火 焰 圈。打开 罐体放 气 阀使压力 降至0，把火 焰圈 套 在接种 口上，点燃 火焰圈 后关闭 放气阀。打 开接种 口，然 后快、稳、轻地 接入固体 专用 种或 摇瓶 菌种，然 后 拧紧 接种 口的 螺丝。接种 时间 应控 制在10 s 以内，接种 量为1%2%。8.8 液体菌 种培 养 通过气 泵充 气和 调整 放气 阀调节 罐体 压力 表压 力在0.02 MPa 0.03 MPa，温 度 控制在201、通气量为1:0.8 条件 下进行 液 体菌种 培养。金针 菇液体 菌种在 上述条 件下 培养144 h 168 h 可 达到培 养指标。8.9 液体菌 种检 测 接种后 第4 d 进行检 测，首 先用酒 精火焰 球灼 烧取样 阀30 s 40 s 后，弃掉最 初流出 的少量 液体 菌种，然 后用 酒精 火焰 封口 直接放 入经 灭菌 的三 角瓶 中，塞 紧棉 塞，取样 后用 酒精火 焰把 取样 阀 烧 干，以免杂菌 进 入 造成 污 染。将样 品 带入 接 种箱 制 片镜 检或 分 别接 入 到试 管 斜面 或培 养 皿的 培 养基 上，放入28 恒 温培 养48 h 72 h，采用 显微镜 和感 官观察 菌丝生 长状况 和有 无杂菌 污染；若无细 菌、霉菌 等杂菌菌 落生 长，则表 明该 样品无 杂菌 污染。应 在罐 培结束 前完 成。8.10 合格液 体菌 种指 标 8.10.1 感官指 标 感官指 标见 表1。表1 金针菇 液体 菌种 感官 指标 项目 感官指标 菌液色泽 球状菌丝体呈白色，菌液呈棕色。DB37/T 3747 2019 6 表1 金针 菇液 体菌 种感 官指标（续）项目 感官指标 菌液形态 菌液稍粘稠，有大量片状、球状菌丝体悬浮，固形物体积80%，菌丝球直径 2 3 mm、分 布均匀、不上浮、不下沉、不迅速分层，菌球间液体不浑浊。菌液气味 有金针菇液体培养时特 有的香 气，无异味，如酸、臭 味等，培养器排气口气味正 常，无明 显改变。8.10.2 理化指 标 理化指 标见 表2。表2 金针菇 液体 菌种 理化 指标 项目 理化指标 pH 值 5.5 6.0 菌丝湿重（g ml）0.1 0.15 菌丝干重率（%）2 3 显微镜下菌丝形态和杂菌鉴别 可见金针菇菌种液体培 养中特 有的菌丝形态，球状和 丛状菌 丝体大量分布，菌丝粗 壮，菌丝内原生质分布均匀、染色 剂着色深。无霉菌菌丝、酵母 和细菌菌体，检 测 方 法参 照NY/T 1284。留存样品无菌检查 有金针菇菌丝生长，划痕处无霉菌、酵母菌、细菌菌落生长。9 放罐接 种 9.1 接种环 境 应符合GB 50073 标准 要求。9.2 液体菌 种接 种器 消毒 金针菇 液体 接种 器高 压灭 菌后使 用。9.3 接种 将待接 种的 金针 菇三 级固 体种袋（瓶）或 栽培 袋放 置在输 送带 上，输入 至无 菌接种 区。在接 种 区 用接种器 将金 针菇 液体 菌种 注（喷）入，每 袋（瓶）接种量15 mL 30 mL。10 记录与 存档 金针菇 母种、固 体专 用种、摇瓶 液体 种和 培养 器液 体菌种 生产 的每 个环 节都 要有详 实的 生产 记 录，由具体 操作 人员 现场 记录 填写，定 期由 技术 主管 审 核，签字 后归 档保 存，生 产 记录档 案应 保留 至本 批次菌种栽 培出 菇为 止。生产 档案记 录项 目参 见附 录A。DB37/T 3747 2019 7 11 贮藏 液体菌 种生 产好 后，应 立 即进入 菌种 生产 或栽 培袋 接种使 用，若 因某 些原 因 不能立 即使 用时，需降温保压 处理。在 培养 器内 通入无 菌空 气，保持 罐压0.02 MPa 0.04 MPa，液 温6 10 可 保存3 d，11 15 可 保存2 d。DB37/T 3747 2019 8 A A 附 录 A（资料 性附 录）金针菇 液体 菌种 生产 记录 事项 A.1 产地环 境条 件 包括空 气质 量，水源 质量，菌种 生产 设施、配 套设 备及器 具。A.2 生产投 入品 使用 情况 包括金 针菇 液体 菌种 配方，固体 专用 种配 方，摇瓶 菌种配 方、菌种。A.3 金针菇 液体 菌种 生产 关键 环节 包括培 养基 灭菌，接 种，培养，菌种 检测，贮 藏，留样。A.4 其它 包括生 产场 所名 称，菌种 数量，记录 人，入档 日期。_